一、材料与设备

1.标准聚丙烯酰胺凝胶电泳设备，包括电源、电泳槽、夹子、热槽（1/8英寸厚的铝板）。

2.宽而短的凝胶，因为宽的凝胶可以包含更多的浓度梯度，短的凝胶可以减少每个聚丙烯酰胺条需要的肽量，一般尺寸为24cmX36cm或26cmX36cm(hXw)，凝胶的实际尺寸并不是至关重要的，在具体应用时这个操作程序同样可以在其他尺寸的凝胶应用。

3.针对PACE凝胶，梳子和垫片要进行一定的切割，如图11.5所描述对梳子和垫片进行切割，切割以后的凝胶可以包括10个肽浓度。



4.10mlLuer注射器，25gage针头，手套和石蜡膜。

5.低放射性标记物。

6.层析纸，塑料膜和凝胶干燥器。

7.暗盒，X射线片和显影剂。

8.放射物质定量仪器。

9.5XTBE凝胶储存缓冲液和电泳缓冲液：450mmol/LTris碱，450mmol/L硼酸，10mmol/LEDTA（pH8.0）。

10.40%丙烯酰胺储存液（29：1，丙烯酰胺：甲叉甲双丙烯酰胺）。

11.10%过硫酸铵（API水溶液（m/V），99%TEMED。

12.³²P标记的RNA底物，PACE可以使用3"，5"或者内部标记的RNA。可以采用标准的程序制备RNA样品，如果仅有痕量浓度的RNA上样到PACE凝胶，则要求高的放射活性（>200dμm/fmol）。

13.制备并纯化肽或者蛋白。因为PACE测定非常敏感，高纯度和精确浓度的肽是最基本的要求，一般采用反向高效液相色谱（PR-HPLC）或其他的高精度的纯化方法进行纯化，蛋白或肽溶液要用水或合适的储存缓冲液进行系列稀释。储存液通常配制为100X，在使用时稀释100倍。

14.RNA样品稀释到6X的Ⅲ型上样染料中：0.24%溴酚蓝，0.24%的二甲苯青FF，30%的甘油水溶液。

15.考马斯亮蓝蛋白染色：0.24%考马斯亮蓝，45%甲酵的10%冰醋酸水溶液，用来标定PACE电泳的时间。

二、试验方法

1.检测

(1)用去污剂仔细清洗每个凝胶板并用水冲干净，然后再用乙醇淋洗，理想硅化板可以保证灌注后凝胶混合物均匀分布。如图11.6所示安装凝胶板、梳子和垫片，将其旋转90°。滑动取出上部的垫片（S）创造一个灌胶的空隙，在B和P相对的毎个缺口的顶部之间画线，标定每个肽浓度凝胶的灌注高度，标记每个道并记录所使用的肽储存液浓度。



(2)制备200ml凝胶混合物：0.5XTBE，15%(29：1）丙烯酰胺，0.02%的过硫酸铵（20ml5XTBE储存液，75ml40%的丙烯酰胺储疗液，400μl10%的AP，104.6ml重蒸水）。使用时添加盐（Na⁺，K⁺，Mg²⁺等）、去污剂或其他缓冲液成分到合适的终浓度。为了快速完全聚合，使用真空抽气机进行脱气，直到不强烈的产生气泡。如果使用去污剂，要在脱气以后加入，凝胶混合物终体积为200ml。

(3)去除注射器的活塞，用石蜡膜封住针筒下部的孔并保持竖直，加入70.7μl100X肽储存液（或缓冲液，在肽浓度为0的凝胶条使用），加入7ml的凝胶混合物，14μl的TEMED，用手指紧紧的封住针筒的末端，将活塞轻轻地推回到针筒的适当位置，将注射器倒转使针孔向上，让气泡升到上部，移开手指和石蜡膜，不要将注射器指向自己，因为可能会有少量的凝胶混合物喷出，推动活塞直到它完全进入针筒内，然后再堵住针孔。反复颠倒注射器数次以便混匀凝胶混含物，移幵手指推动活塞使气体溢出针筒，直到凝胶混合物刚好要溢出。

(4)安装21gage针头，缓慢的将凝胶从装置的顶部空隙灌注到两个玻璃板之间，直到凝胶达到第一个切口之间的画线。

(5)等待10min以便凝胶进行聚合，在等待的同时，取出注射器，丢弃剩余的混合液到适当的容器。用蒸馏水洗涤注射器和针头以便下一次使用，注意要确保没有残留的水。

(6)凝胶聚合完成后，用一条宽度刚好能够插入到玻璃板之间的Whatman纸在两个板中间滑动，吸出上层的未聚合的凝胶溶液。

(7)重复步骤(4)~(6)，依次改变凝胶中肽的浓度灌注标号为1~8的凝胶条。

(8)减少凝胶底部与垫片S之间的空隙并灌注最后的凝胶条（标号为9）。倾斜装置，以使凝胶溶液流向底部的灌胶梳子，等10min以便凝胶聚合。

(9)如图11.7将装置放平，在灌胶梳子一端稍抬起（大约5cm）。去除凝胶梳子，用Whatman纸将剩余的未聚合凝胶吸除干净。



(10)配制7ml肽浓度为0的凝胶混合物，加入14μlTEMED，然后灌胶直到凝胶混合物到达顶部板的边缘，再加入1mlTEMED，插入梳子，聚合15min。

(11)去除底部的垫片及梳子，将灌好的胶装到电泳槽。

(12)在电泳槽中加入0.5%TBE缓冲液（添加盐或去污剂），洗涤上样孔和去除底部垫片后的空隙，不必进行预电冰，将RNA样品加到适当的上样孔，上样孔一般只能上2μl的样品。

(13)凝胶应该在恒定的低电压下进行电泳，以尽量减少热的产生，21cmX36cm大小，0.8mm厚的凝胶在3W的条件下（不考虑盐的浓度）可以得到好的分离效果，电泳的吋间控制在RNA和肽刚好不跑出凝胶。

(14)电泳结束后取下凝胶装置，移去一块电泳玻璃板，用塑钭膜盖住凝胶，在塑料膜上标记每个泳道的肽浓度，将凝胶从另一个板上剥离，转移到塑料膜上，用Whatman纸覆盖凝胶。

(15)在凝胶干燥器里干燥1h，粘上两点发光的标签作为参照，凝胶对底片曝光适当的时间。

(16)进行底片显影，使其干燥，利用发光标签将凝胶和底片对齐，在含肽的区域和加样孔区域的交界面做标记，测量从该处到每个条带中央的距离，或者是到条带底部的距离(条带有拖影或者跨越了两个道的分界时），重要的是在一个试验中要采用一致的测量方法。