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采用PACE分析RNA肽相互作用实验
实验方法原理 | 聚丙烯酰胺共电泳(poiyacrylamidecoelectrophuresis,PACE)检测是相对较晚发展起来的定量分析蛋白质、肽与DNA或RNA相互作用的方法。 | ||||||
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实验材料 | 低放射性标记物RNA底物 试剂、试剂盒 | TBE凝胶储存缓冲液电泳缓冲液丙烯酰胺储存液过硫酸铵考马斯亮蓝 仪器、耗材 | 聚丙烯酰胺凝胶电泳设备PACE凝胶层析纸塑料膜凝胶干燥器暗盒
实验步骤 | 一、材料与设备 1.标准聚丙烯酰胺凝胶电泳设备,包括电源、电泳槽、夹子、热槽(1/8英寸厚的铝板)。 2.宽而短的凝胶,因为宽的凝胶可以包含更多的浓度梯度,短的凝胶可以减少每个聚丙烯酰胺条需要的肽量,一般尺寸为24cmX36cm或26cmX36cm(hXw),凝胶的实际尺寸并不是至关重要的,在具体应用时这个操作程序同样可以在其他尺寸的凝胶应用。 3.针对PACE凝胶,梳子和垫片要进行一定的切割,如图11.5所描述对梳子和垫片进行切割,切割以后的凝胶可以包括10个肽浓度。 ![]() 4.10mlLuer注射器,25gage针头,手套和石蜡膜。 5.低放射性标记物。 6.层析纸,塑料膜和凝胶干燥器。 7.暗盒,X射线片和显影剂。 8.放射物质定量仪器。 9.5XTBE凝胶储存缓冲液和电泳缓冲液:450mmol/LTris碱,450mmol/L硼酸,10mmol/LEDTA(pH8.0)。 10.40%丙烯酰胺储存液(29:1,丙烯酰胺:甲叉甲双丙烯酰胺)。 11.10%过硫酸铵(API水溶液(m/V),99%TEMED。 12.32P标记的RNA底物,PACE可以使用3",5"或者内部标记的RNA。可以采用标准的程序制备RNA样品,如果仅有痕量浓度的RNA上样到PACE凝胶,则要求高的放射活性(>200dμm/fmol)。 13.制备并纯化肽或者蛋白。因为PACE测定非常敏感,高纯度和精确浓度的肽是最基本的要求,一般采用反向高效液相色谱(PR-HPLC)或其他的高精度的纯化方法进行纯化,蛋白或肽溶液要用水或合适的储存缓冲液进行系列稀释。储存液通常配制为100X,在使用时稀释100倍。 14.RNA样品稀释到6X的Ⅲ型上样染料中:0.24%溴酚蓝,0.24%的二甲苯青FF,30%的甘油水溶液。 15.考马斯亮蓝蛋白染色:0.24%考马斯亮蓝,45%甲酵的10%冰醋酸水溶液,用来标定PACE电泳的时间。 二、试验方法 1.检测 (1)用去污剂仔细清洗每个凝胶板并用水冲干净,然后再用乙醇淋洗,理想硅化板可以保证灌注后凝胶混合物均匀分布。如图11.6所示安装凝胶板、梳子和垫片,将其旋转90°。滑动取出上部的垫片(S)创造一个灌胶的空隙,在B和P相对的毎个缺口的顶部之间画线,标定每个肽浓度凝胶的灌注高度,标记每个道并记录所使用的肽储存液浓度。 ![]() (2)制备200ml凝胶混合物:0.5XTBE,15%(29:1)丙烯酰胺,0.02%的过硫酸铵(20ml5XTBE储存液,75ml40%的丙烯酰胺储疗液,400μl10%的AP,104.6ml重蒸水)。使用时添加盐(Na+,K+,Mg2+等)、去污剂或其他缓冲液成分到合适的终浓度。为了快速完全聚合,使用真空抽气机进行脱气,直到不强烈的产生气泡。如果使用去污剂,要在脱气以后加入,凝胶混合物终体积为200ml。 (3)去除注射器的活塞,用石蜡膜封住针筒下部的孔并保持竖直,加入70.7μl100X肽储存液(或缓冲液,在肽浓度为0的凝胶条使用),加入7ml的凝胶混合物,14μl的TEMED,用手指紧紧的封住针筒的末端,将活塞轻轻地推回到针筒的适当位置,将注射器倒转使针孔向上,让气泡升到上部,移开手指和石蜡膜,不要将注射器指向自己,因为可能会有少量的凝胶混合物喷出,推动活塞直到它完全进入针筒内,然后再堵住针孔。反复颠倒注射器数次以便混匀凝胶混含物,移幵手指推动活塞使气体溢出针筒,直到凝胶混合物刚好要溢出。 (4)安装21gage针头,缓慢的将凝胶从装置的顶部空隙灌注到两个玻璃板之间,直到凝胶达到第一个切口之间的画线。 (5)等待10min以便凝胶进行聚合,在等待的同时,取出注射器,丢弃剩余的混合液到适当的容器。用蒸馏水洗涤注射器和针头以便下一次使用,注意要确保没有残留的水。 (6)凝胶聚合完成后,用一条宽度刚好能够插入到玻璃板之间的Whatman纸在两个板中间滑动,吸出上层的未聚合的凝胶溶液。 (7)重复步骤(4)~(6),依次改变凝胶中肽的浓度灌注标号为1~8的凝胶条。 (8)减少凝胶底部与垫片S之间的空隙并灌注最后的凝胶条(标号为9)。倾斜装置,以使凝胶溶液流向底部的灌胶梳子,等10min以便凝胶聚合。 (9)如图11.7将装置放平,在灌胶梳子一端稍抬起(大约5cm)。去除凝胶梳子,用Whatman纸将剩余的未聚合凝胶吸除干净。 ![]() (10)配制7ml肽浓度为0的凝胶混合物,加入14μlTEMED,然后灌胶直到凝胶混合物到达顶部板的边缘,再加入1mlTEMED,插入梳子,聚合15min。 (11)去除底部的垫片及梳子,将灌好的胶装到电泳槽。 (12)在电泳槽中加入0.5%TBE缓冲液(添加盐或去污剂),洗涤上样孔和去除底部垫片后的空隙,不必进行预电冰,将RNA样品加到适当的上样孔,上样孔一般只能上2μl的样品。 (13)凝胶应该在恒定的低电压下进行电泳,以尽量减少热的产生,21cmX36cm大小,0.8mm厚的凝胶在3W的条件下(不考虑盐的浓度)可以得到好的分离效果,电泳的吋间控制在RNA和肽刚好不跑出凝胶。 (14)电泳结束后取下凝胶装置,移去一块电泳玻璃板,用塑钭膜盖住凝胶,在塑料膜上标记每个泳道的肽浓度,将凝胶从另一个板上剥离,转移到塑料膜上,用Whatman纸覆盖凝胶。 (15)在凝胶干燥器里干燥1h,粘上两点发光的标签作为参照,凝胶对底片曝光适当的时间。 (16)进行底片显影,使其干燥,利用发光标签将凝胶和底片对齐,在含肽的区域和加样孔区域的交界面做标记,测量从该处到每个条带中央的距离,或者是到条带底部的距离(条带有拖影或者跨越了两个道的分界时),重要的是在一个试验中要采用一致的测量方法。
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