一材料与设备

1)[α³²P]UTP或CTP(800Ci/ml,10mCi/ml)。

2)UTP或CTP。

3)T4多核苷酸激酶

4)10XT4多核苷酸激酶缓冲液

5)(γ³²P)ATP(3000Ci/mmol；10mCi/ml)

6)牛小肠磷酸酶

7)DEPC处理的水

8)10X磷酸酶缓冲液

9)TE(pH7.4)

10)5mol/LNaCl

11)TE(pH7.6)

12)T4RNA连接酶

13)[³²P]pCp(3000Ci/mmol；lOmCi/ml)

14)10XT4RNA连接酶缓冲液

15)DMSO

16)ATP，20umol/L。

17无tRNA酶的牛血清白蛋白


二、操作方法

(一）RNA内部标记

1)在体外转录体系中加入5ul[α³²P]UTP或CTP(800Ci/ml，10mci/ml），不加未标记的UTP或CTP或限制它们的浓度为10〜15umol/L,孵育时间最长为1h

2)DNase消化后，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳RNA,纯化标记的全长RNA。

(二）5＇端标记RNA

逋过T4多核苷酸激酶在5＇端标记RNA。这个酶将[32P]由[γ-³²P]ATP上转移到分子的5＇端.伹5＇端标记的RNA分子需要先用牛小肠磷酸酶去除非同位素的5＇磷酸。

1)用DEPC处理的水稀释1〜2ugRNA至终体积为16ul,95℃下放置2min后，冰浴5min,变性RNA

2)加入2ul10X磷酸酶反应缓冲液，2ul牛小肠磷酸酶(1U/ul);37℃反应30min

3)用TE(pH7.4)稀释RNA至终体积为200ul,加6ul5mol/LNaCl如前所述沉淀RNA。

4)用TE(pH7.6)重悬RNA至RNA浓度为0.5ug/ul。取2ulRNA溶液，95℃放置2min后，冰浴5min

5)加10XT4多核苷酸激酶缓冲液4ul[γ³²P]ATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml),iyT4多核苷酸激酶(3〜6U/ul)，于37°C孵育30min

6)用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化已标记的RNA

(三）3＇端标记RNA

利用T4RNA连接酶和过量的[32P]p4以标记RNA的3＇端

1)将1〜2ugRNA于68℃放置2min后，冰浴5min,使之变性

2)加入4ul10XT4RNA连接酶缓冲液，4ulDMSO，1ul20umol/LATP,1ull0ug/ml无RNA酶的牛血清白蛋白，1〜2ugRNA,5〜10ul[³²P]pCp(3000Ci/mmol,lOmCi/ml)，用DEPC处理水补足总体积40ul。4°C孵育过夜。

3)用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化已标记的RNA。