一、材料

1.缓冲液和溶液

(1)氯仿

(2)透析缓冲液

10mmol/LNaCl

50mmol/LTris-Cl（pH8.0)

10mmol/LMgCl₂

需要两份透析缓冲液，每份为噬菌体溶液体积的1000倍，室温保存。

(3)EDTA(0.5mol/L，pH8.0)

(4)乙醇

(5)酚

(6)酚：氯仿（1:1，V/V）

(7)SDS(10%，m/V)

(8)乙酸钠（3mol/L，pH7.0)

(9)TE(pH7.6和pH8.0)

2.酶和缓冲液

蛋白酶K

限制性内切核酸酶

3.凝胶

琼脂糖凝胶（0.7%)，用0.5XTBE，含0.5μg/ml溴化乙锭

4.离心机和转子

SorvallSS-34转子或相当型号

5.专用设备

硼硅酸盐巴斯德吸管（密封）或Shepherd钩

透析袋，煮过

预置56℃的水浴

6.载体和菌株

于CsCl悬浮液中的λ噬菌体颗粒

二、方法

噬菌体悬浮液的透析

1.将制备好的噬菌体悬浮液装入一端打结或用塑料夹进行封闭的透析袋内，然后封住透析袋的另一端，放入含超过1000倍的透析缓冲液和一磁力搅拌器的烧杯中，于室温慢慢搅拌中透析1h。

2.将透析袋转移至另一装有新鲜缓冲液的烧杯中，再透析1h。

3.将噬菌体悬浮液转入聚丙烯离心管中。

不要超过管体积的1/3。

4.在透析过的噬菌体悬浮液中加入0.5mol/LEDTA(pH8.0)至终浓度为20mmol/L。

噬菌体颗粒的抽提

5.在悬浮液中加入蛋白酶K至终浓度为50μg/ml。

6.加SDS至终浓度为0.5%，通过将离心管轻轻地上下颠倒数次进行混匀。

溶液的外观将快速改变，从略显蓝色的噬菌体颗粒悬浮液转变成含病毒DNA和病毒外壳蛋白裂解物的清亮溶液。

7.将消化混合物于56℃温育1h，然后冷却至室温。

8.加入等体积的平衡酚，通过将离心管轻轻上下颠倒数次，混匀有机相和水相，直至形成一完全的乳状液。

9.3000g（5000r/min于SorvallSS-34转子中）室温离心5min将两相分离，用宽口吸管将亲水相转移至一干净离心管中。

10.用1:1的平衡酚和氯仿混合物抽提亲水相。

11.如上所述（步骤9)回收亲水相，用等体积的氯仿重新抽提一次。大规模制备，转入步骤12。

小量制备（从50~100ml培养物中制备的噬菌体）

(1)用标准乙醇沉淀回收噬菌体DNA。

(2)将溶液于室温放置30min。

当加入乙醇后，λ噬菌体DNA将出现丝状沉淀，可用口封住的硼硅酸盐巴斯德吸管或Shepherd钩从溶液中捞出。

(3)将DNA重新溶解于适当体积的TE(pH7.6)中，转入步骡14。

CsCl的去除

12.将亲水相转移至透析袋中。

13.将噬菌体DNA样品于1000倍的TE(pH8.0)中4℃透析过夜，其间TE溶液更换三次。

14.测定溶液260nm处的吸光值，计算DNA的浓度。

1OD₂₆₀=50μg/ml双链DNA。单个噬菌体颗粒大约含有5X10-11μgDNA。噬菌体DNA的得率依赖于裂解培养物中噬菌体的滴度，通常为每升500μg至数毫克。

15.采用适当大小的分子质量标准，经0.7%琼脂糖电泳分析未消化的或已用适当限制酶切割的部分DNA(0.5μg)，检査噬菌体DNA的完整性。

16.将噬菌体DNA于4℃保存。