2007-02-09【分享】我认为最好的在线引物设计软件

给大家提供一些设计引物注意事项，这是有经验的教授告诉我的，他们用眼睛就能看出来:1．引物必须位于起始密码子与终止密码子之间，即CDS之间Start coding:AUG( atg ) Stop coding: UAA、UAG、UGA( taatagtga )2．要使目标序列与内参在同一胶中电泳 则扩增片断长度要差开。且Tm要互相接近3．引物终止于G或C比较好。

谢谢这位战友，可是我的基因出来的是这种结果怎么办？PrimersforPCRTherewere1forwardprimersinthevalidrangeforGCcontent.Therewere4reverseprimersinthevalidrangeforGCcontent.Therewere1forwardprimersinthevalidrangeformeltingtemperature.Therewere0reverseprimersinthevalidrangeformeltingtemperature.ERRORTheTmrangewastoostringent,noprimerswerefoundinthatrange

楼主你好！这个在线软件看起来比Oligo6.72、primer等软件简单，但该软件似乎只考虑了引物的长度范围、引物的退火温度、引物的GC含量范围，而没有关于引物之间能否形成二聚体方面的信息。而Oligo6.72评价引物则采取了多方面的评价，包括二聚体等信息，但缺点是提供了很多对引物，没有提供最好的，选择哪一对都要靠自己把握。比如我想设计wnt3amRNA的引物，基因系列见：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NM_033131.2。我把该基因序列copy进去后，提示TheGCrangewastoostringent,noprimerswerefoundinthatrange。按照楼主提供的方法降低minimumGC值但仍然出现该提示语，所以我将maximumGC改成90，此时出现TheTmrangewastoostringent,noprimerswerefoundinthatrange，故将MaximumTm改成70，此时出现Theendannealrangewastoostringent,noprimerswerefoundinthatrange，一直找不到－－－

首先输入你想要p的片断，含有数字也无所谓，选择pcr选项。

点击“submit”进入下面的页面。其中在SelectYEStoAmplifyaregionwithEXACTendpointsoftheDNAsequenceenteredNOYES这一项中，一定要选择yes，其他的各项目，大家可以点击查看说明，也都是非常的好理解。暂时，我们先不要改软件自设的默认值，直接submit

然后我们就得到了结果，它会把所有可能的引物都会列出来，而且会把最好的一对帮你挑选出来，ofcourse，我们要选择最好的。

然后点击“ThisistheBESTpairofprimers”就得到了设计好的引物。而且也会显示出“ThesequenceofDNAthatwillbeamplifiedbytheseprimersis”如果你不放心，你可以将该序列和你的原始序列比较一下，不会有问题的了。

当然这是最顺利的情况，但是有时并不是这么简单，例如我前两天帮一个战友设计引物，他想要的序列：atcgatcagattatcaAATaatataccaaaattgatacatatgatacatatgaatg721atatatgttttggatatattatttgttaaaattaattcatcaggtgatgatgtgatgata781atcattgaaaaatgacaaaaATCCcctgattaagtataataaaaatagtaagtaaaaaag841gcaaatttttacttacaaaatattacatattggaataaataatttaatctttcatatata901taactgtgatacatcataaatatatatatagcaaaagaaagatataaattattatcattt961tttttgatcattattgctataattattatcctgcttgtttaactataataatagcaatga1021atgaatcaaaatttaaatgatacgttaaaatccaaccaatatgttataaattttctttca1081ttt

我们直接提交得出的结果：

这样的话，按照默认的设的值并不能得到合适的引物，很明显如果让我们自己人工设，可能就不会考虑这么的详细：首先第一个问题，GC含量太低。

为了重新设计，我们点击浏览器上的后退，回到前一页，也就是默认值的设定这一页。

谢谢这位战友，可是我的基因出来的是这种结果怎么办？PrimersforPCRTherewere1forwardprimersinthevalidrangeforGCcontent.Therewere4reverseprimersinthevalidrangeforGCcontent.Therewere1forwardprimersinthevalidrangeformeltingtemperature.Therewere0reverseprimersinthevalidrangeformeltingtemperature.ERRORTheTmrangewastoostringent,noprimerswerefoundinthatrange

我们可以改两个地方，第一，Optimumprimerlength:Minimumlength:Maximumlength:中，我们可以将Maximumlength改成一个更大的值，例如35；MinimumGC改成20，然后submit，可是我们发现还是有问题。

这一次的原因是引物自己配对的问题，同样我们回到前一页，这次我们把SelfEndAnneal由原来的12改成16，submit。这样我们就得到了新的引物。

就这样，有时默认值不行的，可以微调一样，便很容易得到比较理想的引物。我用了那么久，几乎从来没有问题。大家可以随时点击【info】选项，进一步深入了解每个选项的意思。

因为你太快了，请继续往下看呵呵展开引用simplexuepingwrote:谢谢这位战友，可是我的基因出来的是这种结果怎么办？PrimersforPCRTherewere1forwardprimersinthevalidrangeforGCcontent.Therewere4reverseprimersinthevalidrangeforGCcontent.Therewere1forwardprimersinthevalidrangeformeltingtemperature.Therewere0reverseprimersinthevalidrangeformeltingtemperature.ERRORTheTmrangewastoostringent,noprimerswerefoundinthatrange......

参数改了好多还是不行，要不你再帮我看看，谢谢了，呵呵1ggATCCccgggcagagctggggggggatttgttagcatctcttgataaacttAATtgtct61ctcgtcactgacggcacagagctattgatgggtctcaacccccagctagttgtcatcctg121ctcttctttctcgaatgtaccaggagccatatccacggatgcgacaaaaatcacttgaga181gagatcatcggcattttgaacgaggtcacaggagaagggacgccatgcacggagatggat241gtgccaaacgtcctcacagcaacgaagaacaccacagagagtgagctcgtctgtagggct301tccaaggtgcttcgcatattttatttaaaacatgggaaaactccatgcttgaagaagaac361tctagtgttctcatggagctgcagagactctttcgggcttttcgatgcctggattcatcg421ataagctgcaccatgaatgagtccaagtccacatcactgaaagacttcctggaaagccta481aagagcatcatgcaaatggattactcgtagtactgagccaccatgctttaacttatgaat541ttttaatggttttattttaatatttatatatttataattcataaaataaaatatttgtat601aatgt

看了结果你知道为什么你的引物为什么这么难以设计了，因为N端和C端的性质差别太大，属于极品的那种呵呵。展开引用simplexuepingwrote:参数改了好多还是不行，要不你再帮我看看，谢谢了，呵呵......

很多时候虽然它给出的结果看上去并不是那么好，但是用起来还是没有问题的。你试试我给你设计的这个吧。

N端和C端的差别怎么看，参数怎样修改才好，不会每个都试一下吧，你怎么修改的参数，另外我设计出来的怎么都是上千的大片段，怎么改成几百的，我还有一个基因，可能也是极品，自己设计了两对，摸了n多的条件，到现在也没扩出来，多谢了，再帮帮忙，好人做到底了。呵呵gATAGCTGCCATCGGCTGACCTAGAGAAGACACATCAGCTGATCCTTTGG50ACCCTCTGACTTGAGACAGAAGTTCTGGGCTTCTCCTCCTGCGGCCTAGC100TCTGAGACAATGAACGCTACACACTGCATCTTGGCTTTGCAGCTCTTCCT150CATGGCTGTTTCTGGCTGTTACTGCCACGGCACAGTCATTGAAAGCCTAG200AAAGTCTGAATAACTATTTTAACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAAAAG250AGTCTCTTCTTGGATATCTGGAGGAACTGGCAAAAGGATGGTGACATGAA300AATCCTGCAGAGCCAGATTATCTCTTTCTACCTCAGACTCTTTGAAGTCT350TGAAAGACAATCAGGCCATCAGCAACAACATAAGCGTCATTGAATCACAC400CTGATTACTACCTTCTTCAGCAACAGCAAGGCGAAAAAGGATGCATTCAT450GAGTATTGCCAAGTTTGAGGTCAACAACCCACAGGTCCAGCGCCAAGCAT500TCAATGAGCTCATCCGAGTGGTCCACCAGCTGTTGCCGGAATCCAGCCTC550AGGAAGCGGAAAAGGAGTCGCTGCTGATTCGGGGTGGGGAAGAGATTGTC600CCAATAAGAATAATTCTGCCAGCACTATTTGAATTTTTAAATCTAAACCT650ATTTATTAATATTTAAAACTATTTATATGGAGAATCTATTTTAGATGCAT700CAACCAAAGAAGTATTTATAGTAACAACTTATATGTGATAAGAGTGAATT750CCTATTAATATATGTGTTATTTATAATTTCTGTCTCCTCAACTATTTCTC800TTTGACCAATTAATTATTCTTTCTGACTAATTAGCCAAGACTGTGATTGC850GGGGTTGTATCTGGGGGTGGGGGACAGCCAAGCGGCTGACTGAACTCAGA900TTGTAGCTTGTACCTTTACTTCACTGACCAATAAGAAACATTCAGAGCTG950CAGTGACCCCGGGAGGTGCTGCTGATGGGAGGAGATGTCTACACTCCGGG1000CCAGCGCTTTAACAGCAGGCCAGACAGCACTCGAATGaGTCAGGTAGTAA1050CAGGCTGTCCCTGAAAGAAAGCAGTGTCTCAAGAGACTTGACACCTGGTG1100CTTCCCTATACAGCTGAAAACTGTGACTACACCCGAATGACAAATAACTC1150GCTCATTTATAGTTTATCACTGTCTAATTGCATATGAATAAAGTATACCT1200TTGCAACC

自己搞了几个，好像要把整个都扩出来，太大了吧，不知道这样出来的引物行不行，条件放的太宽吧

1你怎么修改的参数？根据结果里面，哪一项不符合，然后适当的把条件放宽。2都是上千的大片段，怎么改成几百的？我看不懂:?)引物长度是有限制的啊3还有一个基因，可能也是极品授人以鱼，不如授人以渔，对不对？xbwl

这个非常好设计啊，把tm稍微降低就可以了啊，而且肯定也不会影响效率的啊

呵呵，谢谢yunerwenyu，我也是看那项不符合再修改那项，不知道这样放宽条件设计的引物好用吗，你有没有试过这样的能P出来吗？这个扩出来的是1208bp，太长了吧，引物长度是可以改，但是跟PCR产物的长度没有关系吧，我是想问怎么设计几百的PCR产物长度。多谢了，这个设计软件的网站很好用。

我试过，是没有问题的。

请教yunerwenyu：我需要在引物上引入酶切位点怎么办呢？就是有几个碱基会和模板不匹配，是直接把模板的相应位置的碱基修改之后再贴上去搜索引物吗？

请问P的片段哪里搞呀

请教下要设计巢式PCR的引物又该怎么设计呢？要引入酶切位点又该怎么办呢？有联系方式吗？急～～～

我现在按照你提供的网址检索大鼠的GnRH及受体的引物,象没有,不知道是我的操作问题,还是其他原因,你能帮我一下吗

ABIgale98请问P的片段哪里搞呀你要扩的片段序列未知是吗？

yunerwenyu你好，我根据你上面的信息做了设计，请你帮忙看一下这么改合适吗，谢谢！GetprimersPrimersforPCRTherewere0forwardprimersinthevalidrangeforGCcontent.ERRORTheGCrangewastoostringent,noprimerswerefoundinthatrange然后我将MinimumGC:４０MaximumGC:70出来以下结果PrimersforPCRTherewere39forwardprimersinthevalidrangeforGCcontent.Therewere66reverseprimersinthevalidrangeforGCcontent.Therewere19forwardprimersinthevalidrangeformeltingtemperature.Therewere11reverseprimersinthevalidrangeformeltingtemperature.Therewere19forwardprimerswithvalidselfannealvalues.Therewere11reverseprimerswithvalidselfannealvalues.Therewere19forwardprimerswithvalidselfendannealvalues.Therewere11reverseprimerswithvalidselfendannealvalues.Therewere209pairsofvalidprimers.ThisistheBESTpairofprimersListofallvalidpairsofprimers然后我用ThisistheBESTpairofprimers是不是就ｏｋ了

给大家提供一些设计引物注意事项，这是有经验的教授告诉我的，他们用眼睛就能看出来:1．引物必须位于起始密码子与终止密码子之间，即CDS之间Startcoding:AUG(atg)Stopcoding:UAA、UAG、UGA(tAATagtga)2．要使目标序列与内参在同一胶中电泳则扩增片断长度要差开。且Tm要互相接近3．引物终止于G或C比较好。

1cctccgaaaccatgaactttctgctctcttgggtgcactggaccctggctttactgctgt61acctccaccatgccaagtggtgaagttcatggacgtctaccagcgcagctattgccgtcc121AATtgagaccctggtggacatcttccaggagtaccccgatgagatagagtatatcttcaa181gccgtcctgtgtgcccctaatgcggtgtgcgggctgctgcaatgatgaagccctggagtg241cgtgcccacgtcggagagcaacgtcactatgcagatcatgcggatcaaacctcaccaaag301ccagcacataggagagatgagcttcctgcagcatagcagatgtgaatgcagaccaaagaa361agatagaacaaagccagaaaatcactgtgagccttgttcagagcggagaaagcatttgtt421tgtccaagatccgcagacgtgtaaatgttcctgcaaaaacacagactcgcgttgcaaggc481gaggcagcttgagttaaacgaacgtacttgcagatgtgacaagccaaggcggtgagccgg541g版主:你好.以上是我的原文序列,麻烦你帮我设计一下引物好吗,谢谢!

楼主你好！我想问一下，这个软件是不是只能设计已知片段的引物？但在许多情况下，我们所扩增的都是未知的片段，所以如果是设计未知片段的引物，有什么比较好的软件吗？谢谢楼主了！

展开引用xihsxsqq1cctccgaaaccatgaactttctgctctcttgggtgcactggaccctggctttactgctgt61acctccaccatgccaagtggtgaagttcatggacgtctaccagcgcagctattgccgtcc121AATtgagaccctggtggacatcttccaggagtaccccgatgagatagagtatatcttcaa181gccgtcctgtgtgcccctaatgcggtgtgcgggctgctgcaatgatgaagccctggagtg241cgtgcccacgtcggagagcaacgtcactatgcagatcatgcggatcaaacctcaccaaag301ccagcacataggagagatgagcttcctgcagcatagcagatgtgaatgcagaccaaagaa361agatagaacaaagccagaaaatcactgtgagccttgttcagagcggagaaagcatttgtt421tgtccaagatccgcagacgtgtaaatgttcctgcaaaaacacagactcgcgttgcaaggc481gaggcagcttgagttaaacgaacgtacttgcagatgtgacaagccaaggcggtgagccgg541g版主:你好.以上是我的原文序列,麻烦你帮我设计一下引物好吗,谢谢!我根据楼主的说明，把Tm值的范围改成了35-75，引物长度改为18-25，GG含量改为30-70，下面是结果PrimerPairData--------------------------------------------------------------------------------Primersfor1(Entered)TheseprimersareforPCRForward-PrimerCCTCCGAAACCATGAACTTTCTReverse-PrimerCCCGGCTCACCGCCTTGGCTTGTLength:22Length:23PercentGC:45PercentGC:69Tm:56Tm:72Self-Anneal:12Self-Anneal:16End-Anneal:4End-Anneal:8Offset:1Offset:541Pair-Anneal:14Pair-End-Anneal:8Totalvalidprimerpairs:8Theseprimerswillamplifyafragmentof541basepairsThesequenceofDNAthatwillbeamplifiedbytheseprimersis1CCTCCGAAACCATGAACTTTCTGCTCTCTTGGGTGCACTGGACCCTGGCT51TTACTGCTGTACCTCCACCATGCCAAGTGGTGAAGTTCATGGACGTCTAC101CAGCGCAGCTATTGCCGTCCAATTGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGA151GTACCCCGATGAGATAGAGTATATCTTCAAGCCGTCCTGTGTGCCCCTAA201TGCGGTGTGCGGGCTGCTGCAATGATGAAGCCCTGGAGTGCGTGCCCACG251TCGGAGAGCAACGTCACTATGCAGATCATGCGGATCAAACCTCACCAAAG301CCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTGCAGCATAGCAGATGTGAATGCA351GACCAAAGAAAGATAGAACAAAGCCAGAAAATCACTGTGAGCCTTGTTCA401GAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTCCAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTC451CTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACG501AACGTACTTGCAGATGTGACAAGCCAAGGCGGTGAGCCGGG不知道可不可以，请指教！......

很好，感谢楼主共享，以后会请教的，呵呵