实时荧光定量

PCR（Real-TimePCR）实验流程

一、RNA

的提取(详见

RNA

提取及反转录)

不同组织样本的

RNA

提取适用不同的提取方法，因为

Real-Time

PCR

对

RNA

样品的质量

要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止

RNA

的降解，保持

RNA

的完整性。

在总

RNA

的提取过程中，注意避免

mRNA

的断裂；取

2ug

进行

RNA

的甲醛变性胶电泳检

测，如果存在

DNA

污染时，要用

DNaseI

进行消化（因为在处理过程中

RNA

极易降解，建议

体系中加入适量

RNA

酶抑制剂）。

二、DNaseI消化样品

RNA中的

DNA

用

DNaseI消化

DNA

组份

加量

模板(RNA)

10ug

RNaseInhibitor

4ul

DNaseIbuffer

10ul

DNaseI

10ul

DEPC

处理

H2O

至

100ul

混匀，37℃90min

三、RNA

琼脂糖凝胶电泳

1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：

1）称取琼脂糖

0.45g

放入三角瓶中，向其中加入

4.5ml

的

10×MOPS

缓冲液和

39.5ml

的

DEPC

水，放微波炉里溶化。

2）待冷却到

60

摄氏度左右时，加入

1ml

甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上

凝固

30min。

2．取各个

RNA

样品

4

µ

l，加入

6×RNA

电泳上样缓冲液

2

µ

l

混匀，加入变性胶加样孔中。

3．120V

电压下电泳

25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。

4．RNA

电泳结果如下图所示。可见

28S

和

18S

两条明亮条带，无

DNA

条带污染。

四．RNA

反转录为

cDNA

反转录程序(以

MBI

的

M-MLV

为例)