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PCR的问题与优化

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PCR的优化

在PCR的优化开始阶段，应用新的DNA模板，引物或热稳定DNA聚合酶等材料建立的PCR方法，其扩增效果一般总不是最佳的。这种PCR反应通常要求尽量抑制非特异性扩增和（或）增加目的DNA产物的产率。表1列举了一些通常遇到的问题和对PCR反应进行优化的一些推荐方法。

表1PCR扩增的疑难解析

问题	解释	补救措施
目的产物条带在两种阳性对照管与试验管内部呈现明显的非常模糊的带型。目的产物条带有时呈不清晰的成片条带，条带在凝胶中扩散到较期望分子量更小的DNA分子量的区域内。	无效引导或无效延伸	通过建立两个引物不同浓度的PCR系列试验，从中发现两个引物的最适浓度；通过建立降落PCR系列试验，摸索最佳镁离子浓度的水平。应用GC-Melt（Clonte-CH）PCR反应混合液。应用尽可能低的复性温度（即退火温度）考虑添加佐剂，如在反应体系中加牛白蛋白（0.2~0.6mg/ml），二甲基亚砜（5%）或甘油（5%）
目的产物条带在阳性对照管2与试验管内呈现非常模糊的带型，而在阳性对照管1内却又很强的条带。	模板DNA不纯。	重新纯化模板DNA，用酚：氯仿抽提两次，乙醇沉淀回收。纯化后的DNA样品溶解于水中（不含EDTA）。
在阴性对照管扩增出目的条带。	盛模板DNA的塑料器具溶解模板DNA的溶液污染所致。	重新配置新的试剂。
扩增产物呈现明显的分子质量错误的条带。	根据一条或两条引物的非特异性引导。	缩短复性时间或增加复性温度。
扩增目的产物DNA呈现模糊的广泛的成片条带。	要么为引物二聚体所致的扩增；要么为模板DNA过量。	检查引物是否均一及模板DNA序列内是否具有高度重复序列存在。优化每条独立引物的浓度。应用降落PCR和（或）热启动PCR。降低模板DNA的量。

对可能发生在PCR过程中的主要问题的解析

表2描写在PCR扩增反应中可能遇到的一些问题以及提供怎样解决这些问题的一些方法。

表2多种PCR扩增过程的一些疑难问题的诊断与解决方法

症状	可能原因	补救措施
扩增的目的产物条带较弱或不能检测到相应的条带。	试剂不合格；PCR仪有故障；扩增程序设置错误。	在两台不同的PCR仪上用新鲜购买的试剂与老的试剂分别进行PCR，比较其扩增产物结果。
	复性条件不是最合适的。	重新计算引物Tm；应用降落PCR，最好再结合热启动PCR。验证引物浓度，如果必要可优化引物的浓度；若引物显然是问题的症结所在，重新设计合成新的引物。
	被复性结合到模板上的引物不适合延伸。	优化MgCl₂、模板DNA和dNTP的浓度；试验此PCR的pH值的范围；考虑用N-三甲基甘氨酸、N,N-二羟乙基甘氨酸或EPP等具有更低温度变异系数的化学物质替代Tris（Chengetal.1994）。应用新鲜制备的热稳定DNA聚合酶。重新纯化模板DNA以去除抑制物。在恒定复性温度（55℃）条件下增加PCR循环数。如果问题依然存在，添加增强剂（如10%二甲基亚砜，5%PEG6000或10%甘油）。如果问题依然存在，用首次扩增的PCR产物进行1：100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第二次PCR扩增；或者进行嵌套式PCR扩增。应用GC-Melt（CLONTECH）PCR反应混合液。
	变性不完全。	增加变性的时间或者设置更高的变性温度。
	两个引物之间的距离太大。	应用那些能够扩增大DNA片段的热稳定DNA聚合酶。
多种扩增产物条带		应用降落PCR，最好再结合热启动PCR或加强PCR（boosterPCR）。优化MgCl₂、模板DNA、热稳定DNA聚合酶及dNTP的浓度。用首次扩增的PCR产物进行1：100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第二次PCR扩增；或者进行嵌套式PCR扩增；或者从凝胶上切割目的条带作模板重新进行PCR扩增。确证引物的浓度，如果必要，可优化引物的浓度；若问题仍然存在，重新设计合成引物。
引物二聚体过量		应用降落PCR，最好再结合热启动或加强PCR（boosterPCR）；若问题仍然存在，重新设计合成引物，要特别注意引物3’末端的序列。

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