症状

可能原因

补救措施

扩增的目的产物条带较弱或不能检测到相应的条带。

试剂不合格；PCR仪有故障；扩增程序设置错误。

在两台不同的PCR仪上用新鲜购买的试剂与老的试剂分别进行PCR，比较其扩增产物结果。

复性条件不是最合适的。

重新计算引物Tm；应用降落PCR，最好再结合热启动PCR。

验证引物浓度，如果必要可优化引物的浓度；若引物显然是问题的症结所在，重新设计合成新的引物。

被复性结合到模板上的引物不适合延伸。

优化MgCl₂、模板DNA和dNTP的浓度；试验此PCR的pH值的范围；考虑用N-三甲基甘氨酸、N,N-二羟乙基甘氨酸或EPP等具有更低温度变异系数的化学物质替代Tris（Chengetal.1994）。

应用新鲜制备的热稳定DNA聚合酶。

重新纯化模板DNA以去除抑制物。

在恒定复性温度（55℃）条件下增加PCR循环数。

如果问题依然存在，添加增强剂（如10%二甲基亚砜，5%PEG6000或10%甘油）。

如果问题依然存在，用首次扩增的PCR产物进行1：100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第二次PCR扩增；或者进行嵌套式PCR扩增。

应用GC-Melt（CLONTECH）PCR反应混合液。

变性不完全。

增加变性的时间或者设置更高的变性温度。

两个引物之间的距离太大。

应用那些能够扩增大DNA片段的热稳定DNA聚合酶。

多种扩增产物条带

应用降落PCR，最好再结合热启动PCR或加强PCR（boosterPCR）。

优化MgCl₂、模板DNA、热稳定DNA聚合酶及dNTP的浓度。

用首次扩增的PCR产物进行1：100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第二次PCR扩增；或者进行嵌套式PCR扩增；或者从凝胶上切割目的条带作模板重新进行PCR扩增。

确证引物的浓度，如果必要，可优化引物的浓度；若问题仍然存在，重新设计合成引物。

引物二聚体过量

应用降落PCR，最好再结合热启动或加强PCR（boosterPCR）；若问题仍然存在，重新设计合成引物，要特别注意引物3’末端的序列。