—、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

①10ul消化体系的组分。

RNA模板（最多1ug/10ul)                            xul

10XDNA酶缓冲液                                          1ul

DNA酶I，1U/ul(Invitrogen18068-015)          1ul

DEPC处理的水                                             8~xul

②20ul反转录体系的组分。

oligo(dT)12~180.5ug/ul                                  0.5ul

RandomHexamer50ng/ul                                0.5ul

RNA模板（最多1ug)                                     xul

10X缓冲液                                                     2ul

(20mmol/LTris-HCl、pH8.4，500mmol/LKCl，25mmol/LMgCl₂)

25mmol/LMgCl₂                                              4ul

10mmol/LdNTP                                                1ul

0.1mol/L二硫苏糖酵（DTT)                             2ul

RNA酶OUT(40U/u1)1ul

SuuerscriutⅡ(50U/ul)反转录系统（Invitrogen11904-018)1ul

25mmol/LEDTA                                                1ul

DEPC处理的水                                                 补足到20ul

二、方法

1.把上述的10ul消化体系混匀，25°C(室温）孵育15min,然后加入25mmol/LEDTAlul，然后65°C孵育15min，以使DNA酶I失活。

2.每次进行RT-PCR(20ul)时，PCR管应放在冰上混合各种成分。逬行多个反应时除了RNA,可以把所有的试剂混在一起，然后分装。反应条件：25°C孵育10min，42°C保持30~50min,70°C再保持15min,最后在冰上冷却。

3.反转录完成后，最好加入1ulRNA酶H,37°C孵育20min以消化剩余的RNA。用上面所述的PlatinumQuantitativePCRSuperMix-UDG反转录得到的CDNA,即可用作实时PCR的模板，也可于-20°C保存以备将来之用。