连接酶链反应(Ligasechainreaction，LCR)，是在连接酶扩增反应或连接酶检测反应的基础上，引入热稳定的连接酶而建立的类似PCR技术的新方法。LCR既可扩增，又可鉴定DNA异常，与PCR技术一样可用于已知病因的遗传病大面积普查。

• 中文名

• 连接酶链反应

• 外文名

• Ligasechainreaction

• 发明者

• Backman

• 发明时间

• 1997

1. ▪基本原理

2. ▪发展过程

LCR，即在DNA连接酶的作用下，通过连接与模板DNA互补的两个相邻寡核苷酸链，快速进行DNA片段扩增。DNA连接酶可将与模板DNA链互补的两条毗邻寡核苷酸片段连接起来，两条寡核苷酸链接头处存在碱基错配则阻止连接反应的发生。所以通过连接酶反应，可明确区分寡聚核苷酸是否与模板DNA完全互补，检测基因点突变。耐热DNA连接酶在不同温度组成的循环中活性保持不变。这样，在适当的缓冲体系中加入模板DNA。一套寡聚核苷酸片段，耐热DNA连接酶，将上述反应体系加热，使模板DNA在高温下（94℃）一分钟变性，解链；然后将反应体系降至退火温度（65℃），4分钟使模板寡聚核苷酸互补成双链；DNA连接酶催化两相邻的寡核苷酸连接起来。如此循环改变温度，连接反应重复进行，使目的DNA得到扩增。如果两寡核苷酸接头处存在错配碱基，则没有扩增产物的产生，扩增产物可通过聚丙烯酰胺电泳加以鉴定。

连接酶链反应(Ligasechainreaction，LCR)，是Backman1997年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明，并申报了专利.1988年Landegren也进行了该项研究。1988年Backman等又因分离热稳定的连接酶，而申报专利，1991年Backman和Barany分别用耐热DNA连接酶进行了LCR试验。耐热DNA连接酶可以在热循环中保持活性，提高连接反应的特异性，排除了背景扩增和免除了不断补充酶的繁琐程序。合成一对引物A、B，它们完成覆盖了靶序列。经退火与靶序列结合后，A、B间留下一个缺口(nick)，加入连接酶封闭缺口，两引物成靶序列完整的互补链。如果靶序列中有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，变性后引物仍是两个。Lan-degren用生物素标记引物A，用32P标记引物B。用亲和素包被的琼脂糖珠与连接产物反应，检测其放射性。显然，当靶序列中存在点突变时，检测结果是阴性的。用这种方式，Landegren将人β-珠蛋白βA、βC、βS三个等位基因区别开来。Wu等人又引入PCR的原理，在连接反应后，变性、退火、再连接，少量的靶序列就被扩增出来。Barany于1991年报道了耐热连接酶-Taq连接酶的发现及其在LCR中的应用，为LCR的实用化奠定了基础。实际操作时引物为4个，A、A’和B、B’，分别与靶序列的正负链互补。每次连接反应的产物又可在下一轮反应中当模板，靶序列以指数形式扩增出来。用上面提到的标记检测方法，即可检测靶序列中有无点突变。

LCR的特异性首先取决于引物与模板的特异结合，其次Taq连接酶作用的特异性，即Taq连接酶是否仅连接与靶序列完全互补的引物。实验表明Taq连接酶的非特异活性是较低的(<1%)。控制模板、酶的浓度，使反应在接近Taq酶的温度下进行，还可进一步降低非特异连接率。Barany用这一技术，将极少量(<200个分子)的βA、βC和βS区别开来。

LCR的扩增效率与PCR相当。由于有很高的信噪比，其敏感性也很高。用Taq连接酶做LCR只在两个保温点的循环(94℃、1min和65℃、4min)。产物检测也非常方便、敏感。因此可以说LCR是目前检测已知序列中有无点突变的最佳方法。