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LiCl RNA Preparation (Ambros Lab)
LiClRNAPreparation(AmbrosLab)
1)Freezewormsbydroppingintoliquidnitrogen2)Grindtoafinepowderinamortarthatwasprecooledwithliquidnitrogen
3)TransferpowdertoaFalcontube
4)Addanequalvolumeof2XLETS(i.e.,equaltotheoriginalvol.ofworms)
5)Addanequalvolumeofphenol:chloroform(i.e,twicetheoriginalvol.ofworms)
6)Vortexandshakeuntilpowderiscompletelythawed
7)Separatephasesinaclinicalcentrifugeat3000rpm,about5-10minutes,roomtemperature
8)Extractwithphenol:chloroform3xormoreuntilinterfaceisalmostcompletelyclear
9)PrecipitatebyaddingLiCLto0.2Mand3volumesof100%ETOHandputat-20oCfor30minutesorwhateverisconvenient(Igenerallyobserveaprecipitateimmediately)
10)Collectprecipitatebycentrifugationinclinicalcentrifuge,3000rpm,10-15minutesroomtemperature
11)Rinsepelletseveraltimeswith70%ETOHandresUSPendinDEPCtreatedwaterorTE
12)ReadOD260/280onanappropriatedilution:aratioof2.0impliesafairlypurepreparationofRNA
13)ExamineonadenaturinggeltoassesstheintegrityoftheRNA
14)StoreRNAasanethanolprecipitateorat-70oC
(ThetraceamountofDNAcontaminationcanberemovedwithDNAse,ifnecessary)
2XLETS200mMLiCL20mMEDTA20mMTrispH7.82%SDS(Iaddvanadylribonucleosidecomplexesto2mMjustbeforeuse-fromSigma)
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