一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

氯仿

焦碳酸二乙酯（DEPC)处理过的H20(GenHimterR105)

乙醇

70%乙醇洗液（用DEPC处理过的H20配制）

异丙醇

苯酚-胍盐单相溶液（推荐RNApure,GenHunterP501-P503)

磷酸盐缓冲液（PBS)

2.离心机和转头

小离心机

3.专用设备

50ml锥形管

1.5ml小离心管

1000ul(原文为ml。—译者改）移液器

100~150mm平板

P10移液器

Pdytron匀浆器（用于从组织中提取RNA)

二、方法

第一步：RNA提取

方法1:从组织培养物中提取RNA

1.如果细胞贴在瓶壁或平板上，则倒掉培养基，将平板置于冰上。

2.如果细胞是悬浮的，旋转离下细胞，并除去培养基。

3.用10~20ml的冷磷酸盐缓冲液（PBS)漂洗细胞。

4.倒掉PBS，并用1000ul移液器吸去残留的PBS。

5.每100~150mm平板加入2ml苯酚-胍盐单相溶液（RNApure)，以裂解细胞（摇晃平板使溶液分布均匀）。这个体积足够裂解100万~1000万个细胞。

6.将平板放在冰上10min。

7.将裂解液吸到两个标记好的1.5ml离心管中。

方法2:从组织中提取RNA

1.在装有组织的50ml锥形管中，加入至少2ml苯酚-胍盐单相溶液（RNApure),并置于冰上。组织和酚溶液的理想比例至少应该是1:10。

2.用Polytron匀浆器将组织搅匀，直到组织完全分散为止。

3.将管子置于冰上10min。

4.取1ml裂解液，分装到标记好的1.5ml离心管中。

方法3:从血液中提取RNA

1.将血液产品离心，并除去血浆。

2.按照上面从组织中提取RNA的说明逬行操作。

第二步：RNA的纯化

1.每毫升裂解液加入150ul氯仿，涡旋混匀10min。
本方案可以在此处停止，并将裂解液放置在-80°C

2.在4°C以最大转速离心10min。

3.小心地将上清液转移到一个干净的、标记好的1.5ml离心管中。

4.加入等体积的异丙醇，并在冰上放置10min，然后剧烈地混匀或涡旋混匀30s。

5.将混合物在4°C以最大转速离心10min。

6.用1ml预冷的70%乙醇（用DEPC处理过的H₂0配制）洗涤RNA沉淀，在4°C最大转速离心2min。

7.倒掉乙醇。短暂离心后，用移液器吸去残留的洗液。

8.将RNA在5ulDEPC处理过的H₂0中重新悬浮。
注意：如果RNA用于任何扩增反应，悬浮液中不要使用SDS。

9.取1ulRNA(用P10移液器）测定浓度，用1mlH₂0稀释。在260nm下读数，注意1OD₂₆₀=40ug。