一材料与设备

1)5mol/LNaOH

2)寡聚脱氧胸苷(oligo(dT)]纤维素

3)DEPC处理的水

4)1X加样缓冲液：20mmol/LTris-CLPH(6.7).0.5mol/LNaCl,lmmol/LEDTA(pH8.0).0.1%十二烷基肌氨酸钠

5)洗脱缓冲液：lOmmol/LTris-Cl(PH7.6)，lmmol/LEDTA(PH8.0)，0.05%SDS

6)3mol/LNaAc(pH5.2)

7)乙醇

8)TE缓冲液


二操作方法

1)先用l0ml5mol/LNaOH清洗硅化的层析柱，然后用水冲洗。取0.5goligo（df)纤维素干粉加于1m]0.1mol/LNaOH中，倒人柱内，以约l0ml的水冲洗。(层析柱可用硅化的巴斯德吸管堵上已硅化的玻璃棉制成或用容量为2ml的已硅化的一次性柱子

2)用10〜20℃加样缓冲液平衡柱子，至流出液pH约7.5

3)于70°C加热含2mg总RNA的水溶液lOmin，迅速冷却至室温，加等体积的2X加样缓冲液，上样，立即用无菌试管收集流出液。并以一倍柱体积的加样缓冲液洗涤，将流出液于70℃温育5min，重新上柱2次。

4)用5〜10倍柱体积的加样缓冲液洗柱，分步收集洗出液，每份1ml，测定每一收集管的OD₂₆₀。洗脱至OD₂₆₀很小或为零。

5)用2〜3倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A)ˉRNA，以1/3〜1/2柱体积分步收集洗脱液。

6）调整所收集的KNA溶液的乙酸钠浓度至0.3mol/L,加2.5倍体积乙醇，一20℃放置过夜或干冰/乙醇中30min

7)于4°C10000g离心15mim沉淀RNA。弃去乙醇，再用70%乙醇洗沉淀.弃去70%乙醇，晾干沉淀，重溶于少量无RNA酶的TE缓冲液。取在70°C加热5min后，在1%琼脂糖凝胶电泳中检査RNA的质量。

S)poly(A)⁺1RNA溶液可直接于70℃保存，或加3倍体积乙醇保存于一70℃