超亲和性的新型亲和标签系统“PATagSystem”

大阪大学蛋白质研究所藤井勇树、高木淳一
东北大学大学院医学系研究科金子美华、加藤幸成
 
前言

在分析蛋白质的功能时最重要的是如何得到高纯度的蛋白。现今提纯蛋白最常用的方法是亲和标签系统。被统称为「EpitopeTag」的肽标签以及其单克隆抗体组成的系统有FLAG、HA、Myc等多种标签。但是，每个标签系统都有优缺点，并不存在完美的标签系统。于是，在克服了众多难关后我们终于开发出有超高亲和性的新型亲和标签系统“PATagSystem”^1）。
 
PAtag的起源

EpitopeTagSystem（表位标签系统）最重要的是要有高亲和性和高特异性的单克隆抗体和有能够识别的标记（肽）组合。在PATagSystem中有大鼠IgG2a单克隆抗体NZ-1和PAtag（GVAMPGAEDDVV）。但原本NZ-1并不用于亲和标签系统。和现在常用的HA标签系统、Myc标签系统一样，NZ-1本来是为了检测出目的蛋白而使用的抗体（FLAG标签系统是例外，它已经开发出用于亲和标签系统的抗体）^2,3,4,5）。而NZ-1原来的标记蛋白是人的平足蛋白，是与血小板凝集相关的单次跨膜型糖蛋白，在恶性肿瘤细胞中会大量表达。平足蛋白上的血小板凝集因子会和血小板上的C型外源凝集素CLEC-2结合引起血小板凝集，诱发癌细胞进行血行转移^6）。为了验证抑制血小板凝集素是否能抑制癌细胞转移，加藤等人进行了抑制人血小板凝集的抗人平足蛋白抗体的建立实验，实验中得到的抗体就是NZ-1^7）。NZ-1是以人平足蛋白N末端的14个氨基酸残基（EGGVAMPGAEDDVV）对应的合成肽作为抗原建立的，所以NZ-1对人细胞上的平足蛋白有很高的亲和性，而且能够十分有效地抑制人平足蛋白和CLEC-2的结合，有很大可能能够成为抗体药物^6，，8）。另一方面，NZ-1对来自抗原的线性肽有很高的亲和性和特异性，于是我们开始研究是否能将NZ-1这些特性用于亲和标签系统中。
 

图1、3种不同长度的SPR和PAtag的亲和性比较

将C末端上的3种长度的PAtag分别附加到模型蛋白T4lysozyme（T4L）上，再注入已进行NZ-1固定化的传感芯片。分别加入3.125、6.65、12.5、25nM4种浓度的T4L，可以通过1:1bindingmodel进行曲线拟合求出解离常数（K_D値）。曲线显示附加PA14或PA12时差别不大，虽然保持着非常慢的分离速度，但是附加PA10时分离速度有明显加快，K_D値也会增大。
 
亲和标记法的确立

使用单克隆抗体和肽标记的亲和标签系统有很多要求，具体来说要求如下：1）高特异性，能从众多杂质中得到目的蛋白；2）高亲和性，结合了的标记蛋白不会马上分离；3）能够在洗脱时保持蛋白活性；4）为了降低成本，色谱柱希望能多次循环再生使用。等等，能满足以上条件，就是一个好的亲和标签系统。

首先，作为NZ-1的抗原使用的14个氨基酸残基的肽需要决定最短长度，长度越短使用越方便，对附加tag的蛋白的影响也越小。从加藤等人以前使用ELISA进行的表位作图的结果来看，要结合10个氨基酸残基（GVAMPGAEDD）才达到最短长度^9）。为了得到更详细的信息，我们使用表面等离子共振技术（SPR），将10,12,14氨基酸残基3种长度的tag和NZ-1的亲和性比较（如图1）。结果显示，12,14残基tag的亲和性基本上没有改变，10残基tag的分离速度显著加快，亲和性大大降低。我们将维持超高亲和性的必要最短长度的12个残基氨基酸序列命名为PAtag。而且这时得到的PAtag和NZ-1的结合曲线的最大特征是解离速度非常慢。因此我们认为PAtag和NZ-1用于亲和标签系统时，捕获蛋白之后就不会发生分离。事实上实验也证明使用这种方法可以捕获90%以上的目的蛋白（图2）。但是这个特点并不是只有好的一面，因为要得到目的蛋白，最终必须要分离抗体和标签，如果结合太强，分离就会变得困难。使用PAtag法的话不会产生这个问题，因为使用低浓度竞争肽（0.1mg/mL）就能将抗体和标签分离（如图3）。如使用三羟甲基氨基甲烷缓冲液或磷酸缓冲液等生理缓冲液溶解，就能在非常温和的条件下几乎不造成任何损害地洗脱出目的蛋白和抗体微珠。另外，PAtag法的另一大特征是可使用高浓度镁离子令PAtag和NZ-1的结合发生分离，具体来说就是使用10mMMES・3MMgCl₂（pH6.0）将已使用并固定化NZ-1的抗体微珠再生利用。在如此温和的条件下再生抗体微珠，可增加抗体微珠的使用次数，大大降低成本。实际上，即使重复以上操作60次，得到的蛋白的量也不会有太大变化^1）。

图2:.在动物细胞表达系中表达的附加PAtag的蛋白结合量的评价

表达有PAtag蛋白的培养上清液（c.cup）和在NZ-1琼脂糖珠上结合标签蛋白的滤过液（flowthrough）进行免疫印迹，就能知道有多少蛋白可与NZ-1琼脂糖结合。使用三羟甲基氨基甲烷将培养上清液和滤过液稀释至1/2、1/4、1/8，使用NZ-1对一次抗体进行免疫印迹。比较目的蛋白分子量约120kDa的条带浓度后发现，流过液的条带明显比培养上清液的条带浅，90%以上的蛋白和抗体微珠结合了。
 

图3.对附加了PAtag的血清蛋白上的HEK细胞的表达上清液进行亲和层析纯化

使用PAtag法对HEK细胞的表达上清液里的血清蛋白进行纯化。C.cup是有血清的表达上清液、flowthrough是未和NZ-1琼脂糖结合的组分、wash是色谱柱洗净后，洗脱时由于肽的影响会发生竞争洗脱的组分。结果，无论PAtag附加在N末端或C末端，都可以很好地只纯化目的蛋白。另外，从wash区域上看不见目的蛋白条带可以看出，结合在琼脂糖上的蛋白几乎没有分离。
 
PATagSystem的使用举例

PATagSystem可用于多数蛋白的纯化，我们已经利用PATagSystem成功纯化了20种以上的蛋白。而且还可以将PAtag附加在目的蛋白的N末端或C末端上，每次附加的位置都要根据分析实验和蛋白的性质来决定。结果如图3所示，PAtag附加到任何一个位置上都可以很好地将目的蛋白进行纯化。图3为分泌蛋白的纯化结果，而我们对膜蛋白质和细胞内蛋白的纯化也已经取得成功，可以纯化分子量约15kDa到500kDa的蛋白。但是使用PA肽洗脱时，每一个阶段都要进行5分钟的孵育。否则很多组分中的蛋白会变得分散。这是由于NZ-1和PAtag的分离太慢造成的，而PA肽和PAtag的竞争结合也需要一定的时间。

另外，除了纯化外还可以将标签用于检测，使PAtag有更高的实用性。使用免疫学的方法在PAtag的帮助下可以更快更经济地检测出目的蛋白。而事实上PATAG/NZ-1可以用于免疫印迹、流式细胞仪或免疫细胞化学检测法（Immunocytochemistry:ICC）^1,10）。由于PATAG/NZ-1有很高的亲和性和特异性，可以迅速地检测出目的蛋白。特别是在使用免疫印迹时这个更加明显，比FLAGTag更容易确认目的蛋白的条带。而且对一次抗体（NZ-1）培养5分钟就可以确认到蛋白质条带（图4）。
具体的纯化、免疫印迹的方法请参考文献¹¹。

图4.使用PATAG/NZ-1法进行免疫印迹

本实验使用表达C末端串联附加FLAGtag、PAtag、IDH1（IDH1-FLAG-PA）的骨肉瘤细胞裂解液为电泳样品。（A）泳道1在一次抗体中加入1μg/Mlnz-1，二抗使用抗大鼠PatagNZ-1抗体，泳道2在一抗中加入3.5μg/Mlm2，二抗使用抗小鼠FLAG抗体，这两个条件的样品的转录膜经CBB染色再进行比较。结果由于二抗不同产生了一些差别，用PATAG/NZ-1法可以很好地见到目的条带。（B）在一抗中加入1μg/Mlnz-1，二抗使用抗大鼠PatagNZ-1抗体的条件下，对一次抗体孵育时间进行修正。结果，孵育1分钟即可清晰观察到条带，孵育5分钟则条带浓度达到饱和。
 
结语

PATagSystem是非常强力的亲和标签系统，由于NZ-1抗体原来是人平足蛋白抗体，所以用于人或猴子源的平足蛋白的细胞株（HEK、COS-1、COS-7细胞等）中会有些问题点，不过只要多加注意即可。另外，由于平足蛋白是膜蛋白，不会在细胞外分泌，使用这些细胞株不用担心内因性的平足蛋白可能会受到污染。而且，根据细胞株的不同，即使发现了有平足蛋白，也只会和NZ-1弱结合，可广泛用于膜蛋白和细胞内蛋白。如果将平足蛋白一起进行纯化，平足蛋白的分子量（约37kDa）和目的蛋白的分子量只要分开一定程度，之后可以用硅胶过滤等方法分离。

蛋白纯化会根据蛋白自身的原因而导致结果不同，如果无法顺利进行纯化的话则需要尝试使用多种方法。如果研究人员使用当前方法无法顺利进行，可以尝试使用PATagSystem，同时也可以在新开始做动物细胞表达系蛋白纯化时作为启动试剂盒使用。

我们已经知道了NZ-1抗体和PA肽的复合体的结晶型结构，由于结合在NZ-1上的PA肽有非常独特的立体结构，我们正在研究如何通过这个特别的构造使PATagSystem有更新型的使用方法。
 
[参考文献]

1）Fujii,Y.etal.:ProteinExpr.,Purif.,95,240-7（2014）.
2）Field,J.etal.:Mol.Cell.Biol.,8,2159-2165（1988）.
3）Evan,G.I.etal.:Mol.Cell.Biol.,5,3610-3616（1985）.
4）Hopp,T.P.etal.:Nat.Biotechnol.,6,1204-1210（1988）.
5）Einhauer,A.etal.:J.Biochem.Biophys.Methods,49,455-465（2001）.
6）Kato,Y.etal.:CancerSci.,99,54-61（2008）.
7）Kato,Y.etal.:Biochem.Biophys.Res.Commun.,349,1301-1307（2006）.
8）Kaneko,M.K.etal.:CancerSci.,103,1913-1919（2012）.
9）Ogasawara,S.etal.:Hybridoma（Larchmt）,27,259-267（2008）.
10）Kaneko,M.K.etal.:Biochem.Biophys.Res.Commun.,432,40-45（2013）.
11）藤井勇樹ら:蛋白質科学会アーカイブ,7,e075（2014）.