2021-08-11【求助】自己制备的多克隆抗体做WB有三条带

genius_at 制备出的抗体通过了GST的柱子消除了与我的抗原有交叉反应的抗体这句可能有问题。是商品化纯化GST融合蛋白的柱子吗？那是不对的。应该用纯化的GST蛋白接柱去纯化多抗，消除可能的交叉。另外，多抗的特异性抗体含量一般不超过20%，最好过一次自己的抗原柱进行特异性的纯化。

如果你觉得纯化没问题，那就看看你的蛋白是否有二聚体或是降解，还有，如果你的抗体可以IP的话，可以试试做个IP后再来做WB，条带会比较单一。

skykiller这句可能有问题。是商品化纯化GST融合蛋白的柱子吗？那是不对的。应该用纯化的GST蛋白接柱去纯化多抗，消除可能的交叉。另外，多抗的特异性抗体含量一般不超过20%，最好过一次自己的抗原柱进行特异性的纯化。谢谢！可能是我没说明白，不是商品化纯化的GST融合蛋白的柱子。是与我所要蛋白有交叉反应的同一家族的另一个成员的GST融合蛋白，这样既把GST交叉反应抗体给去掉，又把这个家族成员的抗体给去掉了。现在我过了一下我所要的蛋白的GST融合蛋白的柱子来抓抗体，那些杂带没有结合，在过抗体的时候就给去掉了，但是我之后用GST洗脱液洗脱后的液体做WB也没有带了，是不是需要再过一下MillporeMontage的抗体纯化试剂盒还是洗脱液的PH值不对呢？

mwliu如果你觉得纯化没问题，那就看看你的蛋白是否有二聚体或是降解，还有，如果你的抗体可以IP的话，可以试试做个IP后再来做WB，条带会比较单一。谢谢！我觉得还是纯化的问题~~

genius_at谢谢！可能是我没说明白，不是商品化纯化的GST融合蛋白的柱子。是与我所要蛋白有交叉反应的同一家族的另一个成员的GST融合蛋白，这样既把GST交叉反应抗体给去掉，又把这个家族成员的抗体给去掉了。这一步应该收集的是柱穿透样，是吧？genius_atwrote:现在我过了一下我所要的蛋白的GST融合蛋白的柱子来抓抗体，那些杂带没有结合，在过抗体的时候就给去掉了，但是我之后用GST洗脱液洗脱后的液体做WB也没有带了有洗脱峰吗，纯化抗体浓度、纯化的规模有多大？用什么溶液洗脱的？genius_atwrote:是不是需要再过一下MillporeMontage的抗体纯化试剂盒还是洗脱液的PH值不对呢？个人没有用过这个试剂盒。但如果是通用性的纯化抗体试剂盒，应该也就是ProteinA/G之类的方法。前面已经用抗原亲和柱纯化过了，再过这个柱没有意义。