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使用合成核苷酸作探针实验一在氯化钠/柠檬酸钠中杂交
mayitao
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| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | SSC焦磷酸钠SDS |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 制备双份的转印细菌菌落或噬斑的硝酸纤维素滤膜（处理和干烤过）。 2. 在室温下用3×SDS/0.1%SDS溶液500ml洗膜3~5次。 3. 然后在65℃洗膜至少1.5h以上直至过夜。 4. 在预杂交液中37℃预杂交1h。 5. 在装有20ml以上的SSC杂交液的可封口的杂交袋中可移入多达20张的滤膜。 6. 在毎个杂交袋中每毫升杂交液加入0.125ng至1.0ng的每种32P标记的寡核苷酸。 7. 在以下给定的温度条件下寡核苷酸杂交14~48h。 （1）14碱基——室温 （2）17碱基——37℃ （3）20碱基——42℃ （4）23碱基——48℃ 8. 从杂交袋中取出滤胰，用6×SSC/0.05%焦磷酸盐洗膜液在室温冼膜3~5次，每次5~15min。 9. 再用预热的洗膜液洗膜30min。预热温度与寡核苷酸片段长度有关。 （1）14碱基——37℃ （2）17碱基——48℃ （3）20碱基——55℃ （4）23碱基——60℃ 10. 如果滤膜高于本底放射性活性，则需要将洗膜温度升高2~3℃，并延长洗膜15~30min。 11. 重新作放射自显影检测。但不得超过以下对应的温度： （1）14碱基——41℃ （2）17碱基——53℃ （3）20碱基——63℃ （4）23碱基——70℃ 12. 用塑料薄膜包裹滤膜，放好，使用增感屏在-70℃对X光片曝光14~72h，双份滤膜均对X光片曝光，如果在同一位置出现曝光点，那么该位置对应的细菌菌落或噬斑为阳性。 |
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