一、材料

1.缓冲液与溶液

10X扩增缓冲液

4种dNTP贮存液（20mmol/L，pH8.0)

2.酶与缓冲液

热稳定DNA聚合酶

3.凝胶

聚丙烯酰胺凝胶

4.核苷酸与寡核苷酸

DNA模板（100μg/ml，基因组DNA或cDNA基因文库）溶于TE中（pH8.0)

反义寡核苷酸库（10μmol/L）溶于TE中（pH8.0)

正义寡核苷酸引物库（10μmol/L）溶于TE(pH8.0)

5.特殊设备

自动微量移液器的屏蔽型枪头

离心管（0.5ml，薄壁扩增反应专用离心管）

正向排液式移液器

PCR仪

二、方法

1.按以下次序，将各成分加入到一只0.5ml灭菌离心管、扩增管或灭菌微量滴定板的孔内，混合：

0.5μg模板DNA                                  5μl

10X扩增缓冲液                                    5μl

20mmol/L4种dNTP混合液（pH8.0） 5μl

10μmol/L正义引物库（70pmol）          7μl

10μmol/L反义引物库（70pmol）          7μl

1~2单位热稳定DNA聚合酶                  1μl

H₂O补足至                                          50μl

设置几支对照反应管。在一只对照管中加入除了模板DNA外的所有上述试剂。第二支加入除去一种引物以外的所有上述试剂。

2.如果PCR仪没有配备加热盖，在反应混合液的上层应加一滴矿物油（约50μl），防止样品在PCR反应多个加热与冷却的循环过程中蒸发。如果应用热启动PCR程序，在反应混合液的上层加一层石蜡油。放置离心管和微量滴定板在PCR仪上。

3.按以下方法进行PCR扩增。典型的程序有变性、复性和聚合（延伸反应）；相应的循环条件与温度列表如下：



4.抽取每种扩增样品5~10μl用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析扩增结果，用DNAMarker来判断扩增片段的大小。凝胶一般用EB(溴化乙锭）或SYBR金颗粒染色后来观察扩增的量与片段大小。

如果针对一条连续氨基酸序列设计正义和反义引物用于MOPAC反应，目的扩增产物的大小将是已知的。在大多数情况下，薄层聚丙烯酰胺凝胶（<6%)可用于能分辨核苷酸序列大小的分级分离使目的产物获得明确的鉴定。一种鉴定方法为扩增产物能被末端标记和进行其化学序列分析确定与两套寡核苷酸库相结合的一条惟一的序列。这种惟一序列最终能被合成和用于作为分离与筛选更长的cDNA基因的探针。另一种可供选择的方法是，MOPAC产物自身在第二轮PCR中被标记和用作探针。如果酶切位点被设计在起始寡核苷酸引物的5末端，因而这种扩增片段经相应的内切酶清化后易于克隆到相应的质粒或噬菌体载体上。

5.若用矿物油覆盖在微量离心管内样品液体的上层，反应结束后可用150μl氯仿抽提去除。

在PCR反应管内，包含扩增DNA片段的水相与上层矿物油的界面形成弯月面，在弯月面下面的水相还有微胶粒。可用自动移液器小心吸取水相液体转移到一个新的离心管内。

为了许多目的，如用Cemricon微量浓缩器纯化扩增DNA片段，或者克隆扩增产物，在进行实验操作前去除反应管上层的油相是必要的。