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植物蛋白质组学中的双向电泳技术实验一植物蛋白质组学中的双向电泳技术
蚂蚁淘
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| 试剂、试剂盒 | 尿素裂解溶液IPG干胶条水化液IPG胶条平衡液SDS凝胶缓冲液电极缓冲液储液丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺溶液过硫酸铵溶液琼脂糖溶液 仪器、耗材 | 等电聚焦仪IPGphor多重垂直SDS电泳仪
实验步骤 | 3.1第一向：在IPG胶条中进行等电聚焦（IPG-IEF) 采用IPG(IPG-Dalt)的双向电泳技术的第一向，等电聚焦（IEF)是采用独立的，3mm宽的，附着在GelBond PAG支持膜上的IPG胶条进行的。目前已有7cm、11cm、18cm和（或）24cm长的几乎所有需要的pH范围的预制Immobiline干胶条。例如，宽pH范围的IPG3~10和IPG3~11，中等pH范围的IPG4~7或IPG6~9,窄pH范围的IPG4~5或IPG4.5~5.5(如GE Healthcare，Bio-Rad，Sigma-Aldrich，Serva)。或者也可使用实验室自制IPG干胶条。关于IPG灌制的细节，有兴趣的读者可以参考之前发表的方法[21]。 在进行IEF之前，需要水化IPG干胶条，然后再将胶条置于水平等电聚焦仪的冷却盘上[13，22]。最近，一种叫做IPGphor的整体系统的使用简化并加速了IPCMEF。这种仪器的特点有：在持胶槽中水化单独的IPG干胶条或在水化同时上样，可以选择杯上样，使用高电压（8000V)进行后续IEF，在IPG干胶条放入陶瓷持胶槽后无需再对其进行操作。 当使用pH大于9的IPG胶条时，DTT的消耗会导致碱性端的水平漂移。为消除漂移，在胶条的水化液中，可用二硫代羟乙基（HED) (DeStreak，GEHealthcare)代替DTT等还原剂来保持半胱氨酸中二硫键的稳定。除了能去除漂移外，使用HED使点更清晰并提髙重复性[23]。而且，使用IPGphor，可使如核糖体和核蛋白等等电点大于10的极端碱性蛋白的等电聚焦得到大大的简化。 1.IPG胶条的水化和上样 在进行IEF之前，IPG干胶条必须在水化盒或水化盘中水化至其原始厚度0.5mm。IPG干胶条可用溶解有样品的水化液进行水化（水化上样)[24]或用不含样品的水化液进行水化，然后再用杯上样的方法上样。虽然水化上样更方便，但在样品含有高分子质量(<100kDa)，极端碱性和（或）极端疏水的蛋白质时不推荐使用这种方法。这是因为这些蛋白质不易进入胶内。其原因可能是蛋白质和水化盘壁之间的疏水互作或凝胶基质孔径的限制作用。如果样品体积显著地超出IPG胶条水化后预计达到的体积，后一种现象就特别明显。高分子质量蛋白质更可能留在多出的水化液中而不是进入IEF胶中。交叉污染也是一个问题，因此水化盘在不同次实验之间必须彻底清洗。总之，水化上样不如杯上样可靠，特别是在定量实验中。 在杯上样中，IPG干胶条仍旧用水化液水化。IPG胶条水化后，将溶解在裂解缓冲液中的样品（20~100μl)加入在IPG胶条表面上的一次性塑料或硅胶杯中（见注释3)。将样品加在pH极端位置时效果最好，也就是靠近阴极或阳极。大多数情况下在阳极附近上样比在阴极附近上样更好。当使用碱性pH梯度，如IPG6~12或9~12，所有样品都必须从阳极上样[15~17]。 单根IPG胶条的蛋白质上样量由几个因素决定。按照经验：分离距离越长（也就是胶条越长），pH梯度范围越窄，蛋白质检测方法越不灵敏，则所需蛋白质越多。20cmX20cm的分析用（银染）双向电泳凝胶的推荐上样量为50~100μg，微量制备凝胶的推荐上样量多至1mg(或更多）。当使用非常窄的pH范围的IPG胶条时，我们强烈建议仅使用预分离后的样品[25]。 1)用水化盘水化IPG干胶条 (1)如果在水化的同时上样[24]，则直接将细胞裂解产物或组织样品（5~10mg蛋白质/ml)溶解至适量的IPG干胶条水化液中。水化180mm长、3mm宽的胶条时，可吸取350μl上述溶液置于IPG干胶条水化盘中的凹槽中（图13-2)。如IPG胶条更长或更短，水化液体积需要进行相应换算（如240mm长的IPG干胶条用450μl)。 (2)从IPG干胶条表面撕去保护膜，将IPG胶条胶面朝下放入凹槽中，同时避免产生气泡。然后用IPG干胶条覆盖油覆盖IPG胶条（避免水化时胶条变干）。覆盖前胶条应能够活动且没有粘在水化盘上。覆盖后在约20°C条件下过夜水化IPG胶条。温度过高（>37°C)有氨基甲酰化的危险，而温度过低（<15°C)会导致尿素在IPG胶中结晶。 (3)如果使用杯上样，则将IPG干胶条用没有样品的水化液在水化盘中仍旧按上述第二步的方法过夜水化。 2)用IPGphor持胶槽水化胶条并同时上样 (1)用样品溶解缓冲液（也就是尿素/硫脲裂解缓冲液）溶解蛋白质并用IPG干胶条水化缓冲液稀释提取液。 (2)将所需数量的IPGphor持胶槽（图13-2)置于IPGphor的冷却盘/电极区域。 (3)吸取350μl溶有样品的水化液（使用180mm长的IPG胶条时）放入持胶槽底部。 (4)由IPG胶条上去除保护膜，然后缓慢地将IPG胶条（胶面朝下）放入水化液中。避免产生气泡。胶条应仍然能够活动且没有粘在水化盘上。用1~2mlIPG干胶条覆盖油覆盖IPG胶条然后盖上塑料盖。按压在盖子下的支撑块以确保IPG胶条在水化时与电极保持良好接触。水化时加低电压（30~50V)以使高分子质量蛋白质更好地进入胶内[15，28]。  2.在平板仪器上进行IPG-IEF(MultiphorllUnit) 满足下列条件时，水化后的IPG胶条可以直接放在IEF仪器的冷却板上：①如果运行时间不超过12h(经常发生在宽的或中等pH范围IPG，如IPG3~10或4~7)。②如果pH梯度不超过pH10.0。③如果只用杯上样的方法加很小体积的样品(20μl)[3，22]。使用Immobiline干胶条试剂盒中的上样杯更方便进行大体积的样品上样(直至100μl)。当用干胶条试剂盒进行IEF时，IPG胶条可以用硅树脂油或干胶条覆盖油覆盖。当样品为极端碱性（pH>10.0)蛋白质或用窄pH梯度（pH范围<1单位）进行微量制备电泳时必须用覆盖油等覆盖；而当pH范围较宽且pH梯度不超过pH10.0 (如IPG4~7或3~10)时，使用干胶条试剂盒时可不加覆盖油。 (1)将冷却盘放入Multiphorll电泳仪中。吸取3~4ml煤油或IPG干胶条覆盖油加在冷却盘上，然后将Immobiline干胶条盘放在冷却盘上（图13-2)。在胶条盘和冷却盘之间避免产生气泡。 (2)将胶条盘上的电极连至Multiphor II电泳仪上。 (3)将10ml左右的IPG干胶条覆盖油或硅树脂油注入胶条盘中，将波纹状的Immobiline胶条标尺放在胶条盘中的覆盖油的顶端。 (4)IPG胶条水化后（见13.3.1节1.1)，用干净的镊子从水化盘中取出水化好的IPG胶条。用去离子水冲洗胶条，然后将胶条放在两层湿润的滤纸之间，用滤纸吸胶条上多余的覆盖油几秒。这样能够防止IEF过程中尿素在胶表面结晶。转移水化后的IPG胶条（胶面朝上且酸性端对准阳极）放入槽中并靠近标尺。排列IPG胶条并保证对着阳极的胶条边缘排列整齐。 (5)切取两条IEF电极条（GE Healthcare)或由厚2mm的滤纸（如MN440，Macherey Nagel，Germany)制成的滤纸条，其长度为所有IPG胶条在胶条盘中排列的相应宽度。用去离子水浸泡电极条，再用滤纸吸走多余液体，然后将湿润的IEF电极条放在排列整齐的胶条的阴极和阳极附近。 (6)将电极放在IEF电极条上并轻轻向下按压电极。 (7)如果样品已经在水化时进入胶条，则用约80ml干胶条覆盖油覆盖胶条，然后转至第12步。如果用杯上样方法，则继续第8步。 (8)将上样杯放入上样杯槽中，但要避免接触胶条表面。而且，确保上样杯与阳极(或阴极，如果使用阴极上样）之间有几毫米的距离。 (9)将上样杯移动至合适位置，每个胶条上一个上样杯，然后轻轻向下压上样杯。上样杯要和胶条紧密接触但不能损坏胶条表面。 (10)放好上样杯之后，向胶条盘中注入约80ml的干胶条覆盖油以完全覆盖IPG胶条。如果覆盖油漏入上样杯，吸出覆盖油，重新调整上样杯，再次检查是否漏液。在每个上样杯中加入几滴干胶条覆盖油。如果使用pH为3~10的宽pH梯度进行IEF，加覆盖油这一步可以省略。 (11)吸取样品并加人覆盖油下的上样杯底部。再次检查是否漏液。 (12)关闭等电聚焦箱的盖子，根据表13-1中的参数开始电泳。为使样品更好地进入胶内，最初几小时的电压应被限制在150V、300V、600V。然后用最大电压3500V电泳至稳态（见注释4)。电流限制在0.05mA/IPG胶条。最佳聚焦温度是20°C[26]。 (13)当IEF结束后，从胶条盘中取出电极、上样杯槽和IEF电极条。用干净的镊子从胶条盘中取出IPG胶条。如果IPG胶条不被立刻用来进行第二向电泳和（或）用来进一步研究，可将它们夹在两层塑料膜之间贮存在-70°C，可贮存数月。   3.使用IPGphor电泳仪进行IPG-IEF 使用一种叫做IPGphor(GEHealthcare，最近Bio-Rad也开发出一套类似的系统）的整体系统可使双向电泳中的IPG-IEF简化IPGphor包括一个可精确控温（在19.5~20.5°C)的Peltier元件和一个可编程的电源。这个仪器的核心部分是不同长度的（7cm、11cm、13cm、18cm或24cm)氧化铝陶瓷制的细槽，被称为持胶槽。IPG胶条可在持胶槽中水化并同时上样，然后进行IEF。当胶条被放入持胶槽后，后续步骤无需对胶条进行进一步操作（图13-2)。IPGphor是可编程的，而且最多可以存储10组不同程序。该仪器支持延迟启动，这使得使用者可以在下午在持胶槽中用含有样品的水化液水化胶条，然后晚上IEF自动启动并在第二天早上结束。 当在碱性pH范围内（＞pH10.0)进行蛋白质分离时，用杯上样的方法单独对不同的水化好的IPG胶条上样比用水化上样的方法上样得到的分离效果好得多。可以使用特殊杯上样（“通用”）IPGphor持胶槽，或复合式杯上样持胶槽（“复合式”）进行样品的杯上样（图13-2)。杯上样最多允许上100μl样品（见注释3)。持胶槽平台能够调节温度并能将持胶槽与电源连接。除了操作简单外，IPGphor的另一个优势是聚焦时间短。这是因为用IPGphor能在很髙的电压下（最高8000V)进行IEF。 使用IPGphor进行IEF的典型工作条件见表13-2和表13-3。正如前文指出的那样，为了使高分子质量的蛋白质更好地进入聚丙烯酰胺胶内，水化时应在胶条两端加低电压（30~50V)，否则将给水化上样造成困难[15，28]。然后电压逐步升高至8000V。如果IPG胶条的分离长度<11cm，电压应限制在5000V内。为在分离含盐量高的样品或使用窄pH间隔分离样品时得到最佳效果，在电压升髙至8000V之前可在电极和IPG胶条之间垫上湿润的滤纸片（尺寸：4mmX4mm)(见注释4)。当IEF结束后，按13.3.1节2.第13步中的方法贮存IPG胶条。    1)水化上样IEF (1)将所需数量的持胶槽放在冷却盘或IPGphor的电极区（图13-2)上。吸取适量（如180mm长IPG胶条吸取350μl）的含有样品的IPG干胶条水化液注入持胶槽中，将IPG胶条胶面朝下放入水化液中，然后用IPG干胶条覆盖油覆盖。具体方法见13.3.1节1.2)。 (2)设置IPGphor (所需的水化时间、伏小时、电压梯度）。 (3)IPG胶条水化后（至少需要6h，通常过夜），按表13-2所列参数开始IEF。 (4)IEF完成后，将那些不立刻进行第二向电泳的IPG胶条夹在两层塑料膜之间贮存于-70°C。 2)杯上样IEF (1)在水化盘中用不含样品的水化液水化IPG干胶条。IPG胶条水化后，用干净的镊子将水化好的IPG胶条从水化盘或水化盒中取出。用去离子水冲洗胶条，然后将胶条放在两层湿润的滤纸之间，用滤纸吸胶条上多余的覆盖油几秒。这样能够防止IEF过程中尿素在胶表面结晶。见13.3.1节2.。 (2)将所需数量的杯上样持胶槽放在冷却盘或IPGphor的电极区上，确保持胶槽的尖端（阳极）与电极区的阳极区相连。可以使用复合式持胶槽代替独立持胶槽。 (3)将水化好的IPG胶条放入杯上样持胶槽（或复合式持胶槽）中，胶面朝上且胶条尖端（酸性端）对准阳极。确保IPG胶条的阴极距离槽的末端约1.5cm且通过电极丝与电极连通。 (4)用去离子水润湿两张电极滤纸垫片（尺寸：4mmX10mm)，用滤纸吸掉过多的去离子水，然后将润湿的电极滤纸垫片放在阳极和阴极电极与IPG胶条之间IPG胶条的表面上。如果必要（如当样品含盐量高），数小时后可以更换新的滤纸垫片。 (5)将活动电极放在电极滤纸垫片上。夹紧电极使其紧压电极滤纸垫片。 (6)将可移动的上样杯放在阳极或阴极附近，然后轻轻将上样杯压在IPG胶条表面上。上样杯应与IPG胶条紧密接触但不能损伤胶条表面。 (7)为确保上样杯不漏液，向杯中加入100μlIPG覆盖油。如发现漏液，除去覆盖油并用绵纸吸净覆盖油，然后重新放置上样杯。再次检查是否漏液。上样前吸出覆盖油。 (8)每根胶条用2~4mlIPG胶条覆盖油覆盖（建议不要使用硅树脂油或煤油替代IPG胶条覆盖油）。万一覆盖油漏入上样杯，重新放置上样杯并用绵纸吸净杯中的覆盖油。再次检查是否漏液，然后吸取样品（20~100μl)加入上样杯。 (9)设置仪器（所需伏小时、电压梯度、温度等）并按表13-2和表13-3中推荐的参数进行IEF。省去表13-2中为水化上样推荐的低电压水化步骤。 (10)IEF完成后，继续进行平衡或第二向IEF(SDS-PAGE)(见13.3.3节），或将IPG胶条夹在两层塑料膜之间贮存于-70°C，可贮存数月。 3.2IPG胶条平衡 在进行第二向分离（SDS-PAGE)之前，平衡IPG胶条使胶条中分离的蛋白质与SDS充分作用十分重要。由于与载体两性电解质凝胶相比，聚焦后的蛋白质与IPG胶条的结合更加紧密，因此需要相对长的平衡时间（10~15min)以及尿素和甘油来改善蛋白质在第一向和第二向之间的转移效果。其中尿素和甘油可以减轻电渗作用的影响。目前最常用的步骤是将IPG胶条在一种最初由Gorg等[13]提出的缓冲液[50mmol/LTris-HCl(pH8.8)、2% (m/V)SDS、1%(m/V）DTT、6mol/L尿素、30% (m/V)甘油；表13-4中平衡10~15min。然后再将胶条在把上述缓冲液中的DTT换成4%(m/V)碘乙酰胺后形成的缓冲液中进一步平衡10~15min。后面的步骤是用来烷基化游离的DTT，否则DTT会在第二向SDS-PAGE胶中迁移，从而导致点拖尾现象。该现象在银染之后就会被观察到。更重要的是，碘乙酰胺会烷基化巯基并阻止它们的氧化还原作用。我们强烈推荐使用这种还原/烷基化两步程序，这是因为它能够相当程度上简化后续质谱鉴定的样品制备工作（胶内消化蛋白质）。平衡后，IPG胶条被放在第二向水平或垂直SDS-PAGE胶的表面。 (1)溶解100mgDTT(Sigma-Aldrich)至10ml平衡液中以配制平衡液I。 a.为每根胶条准备10ml。 b.将每根聚焦后的胶条放入一个试管（250mm长，内径20mm)中，在每个试管中加入10ml平衡液I。 c.试管用Pamfilm密封后在摇床上摇动15min，然后倒出平衡液。也可使用较短的平衡时间（10min)，不过这样做的风险是在样品进入SDS-PAGE胶时一些蛋白质可能不会从IPG胶条中出来。如果这样，应当在把IPG胶条从SDS胶上取下后将IPG胶条染色，以检查是否所有的蛋白质离幵了IPG胶条。 (2)溶解0.4g碘乙酰胺（Sigma-Aldrich)至10ml平衡液中以配制平衡液Ⅱ。 a.为每根IPG胶条准备10ml。 b.向每根胶条加入10ml平衡液Ⅱ和50μl作为SDS-PAGE指示剂的溴酚蓝（Serva)溶液，再次轻轻摇动平衡15min。 (3)倒出平衡液Ⅱ，进行SDS-PAGE(见13.3.3节）。如果用水平电泳槽（如MuhiphorⅡ)进行SDS-PAGE，用去离子水短暂地冲洗IPG胶条，然后将胶条放在一张滤纸的一边，等待几分钟以吸净多余的平衡液。如果用垂直电泳槽（如EttanDalt)进行SDS-PAGE，用电极缓冲液短暂地冲洗IPG胶条。  3.3第二向：多重垂直SDS-PAGE SDS-PAGE可以在水平或垂直系统上进行[29]。水平设备适用于预制胶（ExcelGelSDS；AmershamBiosciences/GEHealthcare)。而垂直系统则应用于多块胶平行进行的电泳中，尤其是大规模的蛋白质组分析中。这种分析通常需要同时进行数批第二向SDS-PAGE电泳以达到更高的通量和最好的重复性[31]。 1.灌制SDS胶 (1)灌胶胶板（200mmX250mm)由两块书本形状的3mm厚的玻璃板组成。两块玻璃板用一根铰链条连接，玻璃板之间有两条1mm厚的边条。将14块胶板垂直堆入EttanDah II的灌胶模具中。堆叠时铰链条朝右，胶板之间用塑料分隔片（如0.05mm厚聚酯片）分隔。 (2)将灌胶模具的前板放好，旋上螺帽（用手拧紧）（图13-2)。 (3)用环架将一个漏斗支撑在灌胶模具顶端上方约30cm处，用一根聚乙烯管（内径5mm)与之连接。管的另一头与灌胶模具一边的侧室上的金属接口相连。 (4)向侧室中灌入100ml指示剂。 (5)在即将灌胶之前，在凝胶溶液中加入TEMED和过硫酸氨溶液（表13-5)。灌胶时，将凝胶溶液（830ml)注入漏斗。管中避免产生气泡。不要用丙烯酰胺溶液将胶板灌满。这是由于用热琼脂糖将IPG胶条固定在SDS胶顶端时需要一定的空间（约10mm)。 (6)当溶液注入之后，将管从侧室接口上取下。此时侧室中指示剂的水平面会下降。 (7)小心地向每块胶的顶端加入约1ml覆盖液以使胶面平整光滑。 (8)让凝胶在约20°C聚合至少3h，为获得更好的重复性，最好过夜聚合。 (9)胶聚合后，将灌胶模具的前板取下，小心地从模具中取出胶板。可用刀片将胶板分开。将胶板之间的分隔片取下。 (10)用水清洗胶板以除去胶板外表面的丙烯酰胺，然后将多余液体从胶上端排出。由于电泳一次只能用掉12块胶板，应丢弃不理想的胶板，尤其是厚度不均匀的胶板。通常是外侧的胶板。 (11)如果聚合好的凝胶不被立即使用，可将它们用塑料包好贮存在冰箱中（4°C)。最长可贮存2天。  2.使用EttanDaltII垂直电泳槽进行多重SDS-PAGE (1)向EttanDaltII电泳槽下槽中加入1875ml电极缓冲液储液和5625ml去离子水。混合并打开冷却器（25°C)。 (2)将DALT胶板（内有SDS凝胶）垂直放置在胶板架上以便放上IPG胶条。 (3)用电极缓冲液（用水1:1稀释）短暂冲洗平衡好的IPG胶条，将胶条放在DALT胶板顶端。 a.用薄刮刀或尺子推IPG胶条背后支持膜，使胶条进入两层玻璃板之间的空隙中。 b.加入2ml热（75°C)琼脂糖溶液，继续将胶条向下推向SDS胶表面直到两者紧密接触。IPG胶条和SDS胶表面之间避免产生气泡。 c.如需在电泳同时加入分子质量标准蛋白质，可用5μl溶有SDS标准蛋白质的电极缓冲液浸泡一张滤纸片（2~4mm2)。弄干滤纸片后将其放在IPG胶条的左侧或右侧。 d.干燥后的溶有分子质量标准蛋白质的滤纸片可放在微量离心管中贮存于-70°C。 (4)在将胶板放入电泳设备（见第5步）之前让琼脂糖凝固至少5min。对剩余IPG胶条重复上述步骤。虽然将胶条埋入琼脂糖并不是必须的，但这样做能保证IPG胶条和SDS凝胶顶端结合更紧密。 (5)将胶板浸入电极缓冲液使其外侧湿润以便放入电泳槽时更容易。将胶板插入电泳槽中。如有必要，在电泳槽中空着的狭槽中放入空的胶板。将上槽穿过胶板放好，并在其中加入2.5L电极缓冲液（1250ml储液+1250ml去离子水)。 (6)盖上电泳槽的安全盖，并开始SDS-PAGE。开始时以每块胶5mA(设置最高100V)跑大约2h。然后以每块胶15mA(设置最高200V)过夜跑大约16h，或更高的电流以便跑得更快（每块胶30mA大约8h)。 (7)当溴酚蓝踪迹迁移出凝胶下端后终止电泳。 (8)电泳结束后，小心地用塑料刮刀打开胶板。用刮刀将琼脂糖从聚丙烯酰胺凝胶上去除。小心地从玻璃板上剥下凝胶，拎着它的下缘将其放入装有固定液或染色液的盒子里。
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