1.将凝胶放入盛有50ml水的平皿中，在往复式或定轨式摇床上摇动凝胶1Omin。

2.将凝胶转移到盛有25ml磺基水杨酸溶液的平皿中，摇动15mm。

3.再将凝胶放在25ml含氯化钙的磺基水杨酸溶液中，在摇床上摇动30min。

4.迅速用清水洗涤凝胶表面以去除连接在其上的氯化钙。

5.将凝胶转移到25ml0.5mol/LNaOH，用盖子将平皿盖上，在65°C下保温20min。

6.再将凝胶放入25ml钼酸铵溶液中，在摇床上摇动lOmin。

7.重复步骤6。

8.将凝股转移到25ml含硝酸的钼酸铵溶液中，在摇床上摇动20min。

9.将凝胶放人甲基绿溶液中，在摇床上摇动20min。

10.进行脱色，将凝胶转移到25ml硫代硫酸钠溶液，在摇床上摇动15min。

11.重复步骤10，此时可以看见磷酸化蛋白的绿色点。

12.为了使凝胶完全脱色，将其放人25ml的7%乙酸中，在摇床上摇动过夜。在脱色期间，当溶液变绿时，换一次乙酸溶液。

13.在磷酸化蛋白呈现颜色之后，用考马斯亮蓝染凝胶上的总蛋白。