应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质——同源或异源、原核或真核、天然或人工的DNA与载体DNA相结合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆。

• 中文名

• DNA克隆

• 外文名

• DNAcloning

• 性质

• 科学

• 类别

• 生物

1. 1DNA克隆过程

2. 2目的基因的获取

3. ▪化学合成法

4. ▪基因组DNA

5. ▪CDNA

1. ▪聚合酶链反应

2. ▪PCR的基本反应步骤

3. 3克隆载体的选择与改建

4. 4外源基因与载体的连接

1. ▪粘性末端连接

2. ▪平端连接

3. ▪同聚物加尾连接

4. ▪人工接头连接

5. 5重组DNA导入受体菌

1. 6重组体的筛选

一个完整的DNA克隆过程应包括：目的基因的获取，基因载体的选择与构建，目的基因与载体的拼接，重组DNA分子导入受体细胞，筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）。

利用重组DNA技术构建嵌合DNA时，欲插入载体DNA的外源DNA片段中即含有我们感兴趣的基因或DNA序列—目的基因。目前获取目的基因大致有如下几种途径或来源。

如果已知某种基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出该多肽编码基因的核苷酸序列后，再利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。利用该法合成的基因有人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽及干扰素基因等。

分离组织或细胞染色体DNA，利用限制性核酸内切酶将染色体DNA切割成基因水平的许多片段，其中即含有我们感兴趣的基因片段。将它们与适当的克隆载体拼接成重组DNA分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。不同细菌所包含的重组DNA分子内可能存在不同的染色体DNA片段，这样生长的全部细菌所携带的各种染色体片段就代表了整个基因组。存在于细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)。基因组DNA文库就象图书馆库存万卷书一样，涵盖了基因组全部基因信息，也包括我们感兴趣的基因。建立基因文库后需要结合适当筛选方法从众多转化子菌落中筛选出含有某一基因的菌落，再进行扩增，将重组DNA分离、回收，获得目的基因的无性繁殖系—克隆。

以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA(complementaryDNA，cDNA)，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受菌体，扩增为cDNA文库(cDNAlibrary)，然后再采用适当方法从cDNA文库种筛选出目的cDNA。与基因组DNA文库类似，由总mRNA制作的cDNA文库包括了细胞全部mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的编码cDNA。当前发现的大多数蛋白质的编码基因几乎都是这样分离的。

(polymerasechainreaction，PCR)：目前，采用PCR获取目的DNA十分广泛，应用这一技术可以将微量的目的DNA片段在体外扩增100万倍以上。PCR的基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5'末端和3'末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。组成PCR反应体系的基本成分包括：模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶（具耐热性）、dNTP以及含有Mg的缓冲液。

1）变性——将反应系统加热至95℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；2）退火(anneal)——将温度下降至适宜温度（一般较Tm低5℃）使引物与模板DNA退火结合；3）延伸，将温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤称为一个循环，新合成的DNA分子继续做为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次）后即可达到扩增DNA片段的目的。

外源DNA片段离开染色体是不能复制的。如果将外源DNA连接到复制子上，外源DNA则可做为复制子的一部分在受体细胞中复制。这种复制子就是克隆载体。重组DNA技术中克隆载体的选择和改进是一项极富技术性的专门工作，目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。

通过不同途径获取含目的基因的外源DNA、选择或改建适当的克隆载体后，下一步工作是如何将外源DNA与载体DNA连接在一起，即DNA的体外重组。这种DNA重组是靠DNA连接酶将外源DNA与载体共价连接的。改建载体、着手进行外源基因与载体连接前，必须结合研究目的及感兴趣基因特性，认真设计最终构建的重组体分子。应该说，这是一件技术性极强的工作，除技巧问题，还涉及对重组DNA技术领域深刻的认识。下面仅就连接方式做扼要介绍。

同一限制酶切割位点连接由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割DNA后产生单链突变（5'突出及3'突出）的粘性末端，同时酶切位点附近的DNA序列不影响连接，那么，当这样的两个DNA片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。

不同限制性内切酶位点连接由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段，具有相同类型的粘性末端，即配伍末端，也可以进行粘性末端连接。例如MboⅠ(GATC)和BamHⅠ(GGATCC)切割DNA后均可产生5'突出的GATC粘性末端，彼此可互相连接。

DNA连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切酶切割的平端之间的连接。原则上讲，限制酶切割DNA后产生的平端也属配伍末端，可彼此相互连接；若产生的粘性末端经特殊酶处理，使单链突出处被补齐或削平，变为平端，也可实行平端连接。

同聚物加尾连接是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移酶(terminaltransferase)作用下，在DNA片段端制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。这是一种人工提高连接效率的方法，也属于粘性末端连接的一种特殊形式。

对平端DNA片段或载体DNA，可在连接前将磷酸化的接头(linker)或适当分子连到平端，使产生新的限制性内切酶位点。再用识别新位点的限制性内切酶切除接头的远端，产生粘性末端。

外源DNA（含目的DNA）与载体在体外连接成重组DNA分子（嵌合DNA）后，需将其导入受体菌。随着受体菌的生长、增殖，重组DNA分子也复制、扩增，这一过程即为无性繁殖；筛选出的含目的DNA的重组体分子即为一无性繁殖系或克隆。在选择适当的受体菌后，经特殊方法处理，使之成感受态细胞(competentcell)，即具备接受外源DNA的能力。根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化(transformation)、转染(transfection)和感染(infection)等不同手段。

通过转化、转染或感染，重组体DNA分子被导入受体细胞，经适当涂布的培养板培养得到大量转化子菌落或转染噬菌斑。由于每一重组体只携带某一段外源基因，而转化或转染时每一受体菌又只能接受一个重组体分子，如何将众多的转化菌落或转染噬菌斑区分开来，并鉴定哪一菌落或噬菌斑所含重组DNA分子确实带有目的基因，这一过程即为筛选或选择。根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况不同，可采取直接选择法或非直接选择法。