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白细胞介素10(IL-10)是一种由多种细胞亚群产生的重要免疫调节因子。
早期研究显示,其主要生物功能为限制炎症反应及调节多种免疫细胞的分化和增殖,例如:T细胞、B细胞、NK细胞、
抗原呈递细胞、肥大细胞、粒细胞等。近来研究结果提示,IL-10也可以介导免疫反应的激活,有助于清除感染及非感染
颗粒且只产生轻微的炎症反应。大量的研究,包括患者IL-10的表达分析、体外实验及动物实验表明,IL-10与自身免疫
性疾病、炎症、肿瘤等疾病的发生、发展关系密切。临床试验主要集中于RA、炎症性肠病、银屑病、器官移植和丙型肝
炎等。虽然试验结果各不相同,但是使我们对IL-10在免疫反应中的作用的认识更加深入,同时也预示IL-10可以成为一
种治疗药物。目前,我国还没有重组基因工程IL-10药物上市,而且在探索如何高效表达具有生物活性rhIL-10的研究尚
处于起步阶段。本研究建立在国内外IL-10重组基因工程研究基础上,拟克隆人IL-10基因,通过原核、真核两种表达系
统表达IL-10蛋白,奠定重组基因工程研制人IL-10的基础。主要研究结果如下:一、依据Genbank中人类IL-10序列设计
一对特异性引物,应用RT-PCR技术,从LPS刺激的外周血单个核细胞中成功地克隆出hIL-10成熟肽编码序列,并将之克
隆入pGEM-T载体,构建出中间载体<WP=91>pGEM-T-hIL-10,转化入大肠杆菌JM109中,经酶切鉴定及序列测定与
分析,与GenBank中发表的(NM000572.2)hIL-10成熟肽编码序列完全一致。为hIL-10基因的表达研究奠定了基
础。二、从中间载体pGEM-T-hIL-10中将hIL-10成熟肽编码序列酶切回收,定向克隆至原核表达载体pET-28a(+)的T7
启动子下游,成功地构建了原核表达载体pET-28a(+)-hIL-10,将表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLyss中获得表达
菌株,经IPTG的诱导获得较高表达,表达蛋白以包涵体形式存在。经薄层扫描确定目的蛋白表达量占菌体总蛋白的
28.7%。Westernblotting分析结果显示,表达产物与抗hIL-10单克隆抗体呈特异性阳性反应。产物经固相金属离子亲
和层析方法初步纯化,并在柱上应用浓度递减的尿素缓冲液对产物进行复性。活性研究结果表明,复性产物具有抑制
LPS刺激的外周血单核细胞表达MHCⅡ分子的活性。三、为了进一步获得高活性、高表达、适用于产业化生产的rhIL-
10,本研究选择应用酵母表达系统对hIL-10进行表达。应用PCR方法从pGEM-T-hIL-10扩增出hIL-10成熟肽编码序
列,并在其上下游分别引入EcoRI和BaxⅠ两个酶切位点,通过定向克隆成功地构建出分泌型酵母表达载体pPICZαA-
rhIL-10。采用电穿孔技术将表达单位转化入酵母菌P.pastorisX-33中,通过提取酵母基因组进行PCR鉴定以及
MD/MM营养表型筛选,初步筛选出10株可表达具有hIL-10活性的酵母菌。小量发酵培养表达菌株,以0.5%甲醇诱导
96小时,培养上清中蛋白经硫酸铵沉淀后,经SDS-PAGE、薄层扫描显示rhIL-10约占样品蛋白总量的10%。产物经固
相金属离子亲和层析方法初步纯化,纯度达94%。活性研究结果显示酵母表达的分泌型rhIL-10具有较原核表达产物更高
的活性。
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