货号：	YB10910ES20
供应商：	蚂蚁淘生物
数量：	1000
英文名：	HieffCloneTMZeroTOPO-BluntSimpleCloningKit
保质期：	6个月
保存条件：	密封干燥保存

HieffCloneTMZeroTOPO-BluntSimpleCloningKit零背景TOPO-Blunt平末端克隆试剂盒（不含MCS多克隆酶切位点）产品描述

本试剂盒是利用拓扑异构酶（Topoisomerase）高效快速连接DNA片段的原理进一步研发而成，与传统的T4连接酶相比，具有以下优势：1）快速，仅需1-5分钟即可完成连接反应。2）高效，无自连现象，阳性克隆率接近100%，无需设置蓝白斑筛选；3）操作简单，从连接到涂板仅需15-20min。操作过程省去冰浴、热激和1h复苏。4）可连接长达10kb目的产物；5）HieffCloneTMTopo-bluntsimplevector不含多克隆酶切位点（MCS），使用者在引入后续酶切位点进行酶切操作时，不会受到MCS位点的影响，从而增加酶切效率以及克隆成功率。

HieffCloneTMZeroTOPO-BluntSimpleCloningKit零背景TOPO-Blunt平末端克隆试剂盒（不含MCS多克隆酶切位点）产品用途

平端PCR产物的克隆。

克隆后PCR产物的快速测序【使用M13F/M13R引物】。

产品组分

组分编号

组分名称

产品货号（规格）

10910ES20（20T）

10910ES60（5×20T）

10910-A

pESI-Bluntsimplevector(30ng/µl)

20µl

5×20µl

10910-B

1kbcontrolinsert(40ng/µl)

5µl

5×5µl

10910-C

10×Enhancer

20µl

5×20µl

运输和保存方法

冰袋运输。-20°C保存，避免反复冻融。有效期一年。

HieffCloneTMZeroTOPO-BluntSimpleCloningKit零背景TOPO-Blunt平末端克隆试剂盒（不含MCS多克隆酶切位点）注意事项

1）pESI-Bluntsimplevector(30ng/ul)插入位点两端不含多克隆酶切位点，需要在PCR设计引物时引入合适酶切位点。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

♣ControlDNA片段的克隆实验
1）在无菌微量离心管中配制下列DNA溶液，以10µl为例。
1kbcontrolinsert(40ng/µl)

1µl

10´Enhancer

1µl

pESI-Bluntsimplevector(30ng/ul)

1µl

ddH2O

7µl

2）混匀上述体系。于室温（20-30℃）反应5min。

【注】：连接反应不可于冰上进行。反应时间不要超过5min，一般1-2min即可完成连接反应，得到足够的重组子。

3）连接产物可直接转化或于-20℃保存。

4）全量10ml加入100ml感受态细胞，轻轻混匀，室温放置5min。

【注1】：也可取5ml连接液，加入50ml感受态细胞中（加入体积不超过感受态细胞体积的1/10)。

【注2】：通常使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室温放置5min便可获得足够多转化子，如果感受态细胞效率较低时，可以按照冰浴热激的标准程序进行。

5）加300-500mlLB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃180rpm振荡培养10min。

6）取200ml菌液涂板（含氨苄抗性的LB或SOC固体培养基），培养过夜（如果预计转化子少，为得到较多克隆，4000rpm离心1min，吸弃掉部分上清，保留100ml，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板）。

♣一般DNA片段的克隆实验
所插入片段为平末端产物，利用高保真酶（如Pfu酶）扩增得到的产物如无非特异性条带、引物二聚体可直接进行连接反应。

否则建议胶回收后使用。

【注】：a、PCR产物不能磷酸化。

    b、如扩增模板为质粒，模板质粒会在后续实验中引起假阳性，因此推荐PCR产物进行胶回收后连接。

1）按照下表配制连接体系（以10µl为例*）

10´Enhancer

1µl

pESI-Bluntsimplevector(30ng/ul)

1µl

插入片段**

0.5-8µl

ddH2O

To10µl

【注】：*可根据具体实验情况按照上述比例调整反应体系。

**不同的插入片段所用量参考下表

插入片段大小（1kb）

最佳用量(ng)

0.1-1kb

20-50ng

1-2kb

50-100ng

2-5kb

100-200ng

2）混匀上述体系。于室温（20-30℃）反应5min。

【注】：连接反应不可于冰上进行。反应时间不要超过5min，一般1-2min即可完成连接反应，得到足够的重组子。

3）全量10ml加入100ml感受态细胞，轻轻混匀，室温放置5min。

【注1】：也可取5ml连接液，加入50ml感受态细胞中（加入体积不超过感受态细胞体积的1/10)。

【注2】：通常使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室温放置5min便可获得足够多转化子，如果感受态细胞效率较低时，可以按照冰浴热激的标准程序进行。

4）加300-500mlLB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃180rpm振荡培养10min。

【注】：通常商品化的感受态细胞不超过2kb插入片段情况下，10min复苏可以得到足够多转化子，如果感受态效率低或者插入片段长转化子少的情况下可以提高复苏时间到30-60min以得到更多的转化子。

5）取200ml菌液涂板（含氨苄抗性的LB或SOC固体培养基），培养过夜（如果预计转化子少，为得到较多克隆，4000rpm离心1min，吸弃掉部分上清，保留100-150ml，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板）。

6）转化子的筛选鉴定
①菌液PCR鉴定；

②质粒大小鉴定：挑取单克隆，抽提质粒后可根据质粒大小进行鉴定。

③酶切鉴定：根据克隆实验设计，选择合适的限制性内切酶进行鉴定。

④测序分析：可选测序引物序列如下

  M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

  M13R：CAGGAAACAGCTATGACC

【注】：本制品阳性率相当高，一般情况下，阳性克隆率接近100%，只要是长出来的菌落正常（不是污染的杂菌，转化子数量也不算太少），基本就是阳性克隆，因此插入片段不超过2-3kb的情况下可以不用鉴定直接挑1-2个菌去测序。

HieffCloneTMZeroTOPO-BluntSimpleCloningKit零背景TOPO-Blunt平末端克隆试剂盒（不含MCS多克隆酶切位点）yb1490   rbCXCL16   重组牛碱性成纤维细胞生长因子   "RecombinantBovineBasicFibroblastGrowthFactor
"   10μg   
yb1491               
yb1492               
yb1493               
yb1494   rProteinA   重组蛋白A   "RecombinantProteinA
"   5mg   
yb1495   rProteinG   重组蛋白G   "RecombinantProteinG
"   5mg   
yb1496   rCysProteinG   重组半胱氨酸-蛋白G   "RecombinantCys-ProteinG
"   5mg   
yb1497   rProteinA/G   重组蛋白A/G   "RecombinantProteinA/G
"   5mg   
yb1498   rStreptavidin   重组链霉亲和素   "RecombinantStreptavidin
"   1mg   
yb1499   rHSA   重组人血清白蛋白   "RecombinantHumanSerumAlbumin
"   1g   
yb1500               
yb1501               
yb1502               
yb1503   ECGS   内皮细胞生长因子   EndothelialCellGrowthSupplement   5ml   
yb1504   SMCGS   平滑肌细胞生长因子   SmoothMuscleCellGrowthSupplement   5ml   
yb1505   SMCGS-sf   平滑肌细胞生长因子（不含血清）   SmoothMuscleCellGrowthSupplement   5ml   
yb1506   PGS   周细胞生长因子   PericyteGrowthSupplement   5ml   
yb1507   MenCGS   脑膜细胞生长因子   MeningealCellGrowthSupplement   5ml   
yb1508   NPrCGS   神经前体细胞生长因子   NeuralPrecursorCellGrowthSupplement   5ml   
yb1509   NGS   神经元生长因子   NeuronalGrowthSupplement   5ml   
yb1510   NPCDS   神经前体细胞分化生长因子   NeuralPrecursorCellDifferentiationSupplement   5ml   
yb1511   OPCGS   少突胶质前体细胞生长因子   OligodendrocytePrecursorCellGrowthSupplement   5ml   
yb1512   OGS   少突胶质细胞生长因子   OligodendrocyteGrowthSupplement   5ml   
yb1513   OPCDS   少突胶质前体分化生长因子   OligodendrocytePrecursorCellDifferentiationSupplement   5ml   
yb1514   SCGS   雪旺细胞生长因子   SchwannCellGrowthSupplement   5ml   
yb1515   AGS   星形细胞生长因子   AstrocyteGrowthSupplement   5ml   
yb1516   AGS-a   星形细胞生长因子-动物   AstrocyteGrowthSupplement-Animal   5ml