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2021-08-03【求助】用QuikChange试剂盒做单点突变，测序后没有突变

三个土
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用QuikChange试剂盒做单点突变，对照质粒都能正常的出结果，但是目的质粒测序3次都没有突变。

说明书上写的可以扩14000bp以内的质粒，我的质粒长度7800bp，引物是32bp，说明书上要求tm值大于78，CG值大于40，按说明书上的算法我的算出来是tm81，CG值是59。

请问是不是我的质粒太大啦？要不我先把目的片段切下来连到T载体（加目的片段有4500bp）上？和我CG值太高也有关系吗？

做了两个月都没成功，急死我了，拜托大家给点意见谢谢啦！！！
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相关回复

已帮助 0人

回复：时间：2021-08-07

GC含量高，体系里加4%-8%的DMSO延伸时间尽可能缩短，最多16-20个循环。PCR后DpnI消化一小时后震荡混匀，离心后再消化一小时如果实在有困难，连T载体应该会容易很多

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回复：时间：2021-08-03

laforetGC含量高，体系里加4%-8%的DMSO延伸时间尽可能缩短，最多16-20个循环。PCR后DpnI消化一小时后震荡混匀，离心后再消化一小时如果实在有困难，连T载体应该会容易很多好的，谢谢前辈啦，我先试试看加DMSO，再把片段切到t载体上试试~~

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回复：时间：2021-08-11

请问，实验结果怎么样了？？？我也在用这种方法，测序显示都没有突变，求指教？？

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回复：时间：2021-08-09

yunlongma请问，实验结果怎么样了？？？我也在用这种方法，测序显示都没有突变，求指教？？我用了小一些的质粒就做出来了····如果还是做不出来那就修改一下反应时间温度循环的条件。这个试剂盒比较贵，所以在摸条件的时候不用按照说明书上的体积，只要比例对就行！

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