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说明书上写的可以扩14000bp以内的质粒,我的质粒长度7800bp,引物是32bp,说明书上要求tm值大于78,CG值大于40,按说明书上的算法我的算出来是tm81,CG值是59。
请问是不是我的质粒太大啦?要不我先把目的片段切下来连到T载体(加目的片段有4500bp)上?和我CG值太高也有关系吗?
做了两个月都没成功,急死我了,拜托大家给点意见谢谢啦!!!
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回复:时间:2021-08-11
GC含量高,体系里加4%-8%的DMSO延伸时间尽可能缩短,最多16-20个循环。PCR后DpnI消化一小时后震荡混匀,离心后再消化一小时如果实在有困难,连T载体应该会容易很多
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回复:时间:2021-08-05
laforetGC含量高,体系里加4%-8%的DMSO延伸时间尽可能缩短,最多16-20个循环。PCR后DpnI消化一小时后震荡混匀,离心后再消化一小时如果实在有困难,连T载体应该会容易很多好的,谢谢前辈啦,我先试试看加DMSO,再把片段切到t载体上试试~~
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回复:时间:2021-08-08
yunlongma请问,实验结果怎么样了???我也在用这种方法,测序显示都没有突变,求指教??我用了小一些的质粒就做出来了····如果还是做不出来那就修改一下反应时间温度循环的条件。这个试剂盒比较贵,所以在摸条件的时候不用按照说明书上的体积,只要比例对就行!
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