YeastProteinIsolation"Yaffe-Schatz"

DavidAmberg

AdaptedfromYaffe,M.P.andSchatz,G.,PNAS,1984,81,4819-4823.

1. Grow25mlsyeastcellsto5x10E6.
2. Sequentiallyspindowncellsina15mlpolyprotube.
3. Washcellswith1mlicecoldddH2O,transferrringtoaneppytube.
4. Recon.cellsin1mlicecoldddH2Ocontaining100ug/mlPMSF.
5. Add150ulicecold2NNaOH+8%2-ME(for1ml400ul5NNaOH+600ulddH2O+80ul2-ME).Mixbyinvertingtubeseveraltimes.Inc.onicefor10min.
6. Add150ulicecold50%TCA,mixbyinvertingtubeseveraltimes.Inc.onicefor10min.
7. Spin2min.inmicrofuge.Washpelletwith1ml.icecoldacetone,spin2min.andaspirateoffthesupernatant.Drypellet.
8. ResUSPendpelletin100ulsamplebuffer:500ul3XSamplebufferpH6.8+500ulddH2O+12.5ul2-ME+25ul1MTRISbase+100ugPMSF+dabofbromphenolblue.Youmayhavetoworkatthis,I"veheardawirehomogenizerdoesthetrick.
9. Heat95¡Cx2-5min.TryloADIng10ulonthegel,mayneedmore.

Note:MakePMSFat10mg/mlinisopropanolandstoreat-20¡C.

• 3XSampleBuffer:
• 0.2MTrispH6.8
• 6%SDS
• 30%Glycerol

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