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Preparation of Yeast Protein Extracts
PreparationofYeastProteinExtracts
(seeClontechYPH,p12)
Crackingbufferstocksolution(seep54ClontechYPH)
8MUrea;5%w/vSDS;40mMTris-HClpH6.8;0.1mMEDTA;0.4mg/mlBMBinH2O
forafinalvolumeof20ml9.6gUrea
1gSDS
0.8ml1MTrisHClpH6.8
4µl0.5MEDTA
8mgBromophenolBlue
Protocol
1.Setup5mlO/NculturesincorrectSDselectionmedium(SD-LeuorSD-Trp).
2.Alsosetupuntransformedyeastasacontrol.Leaveat30°C,230-250rpm,for18-24h.
3.Foreachclonetobeassayed,separatelyinoculate50mlofYPDAwiththeentireO/Nculture.TakeanOD600reADIng.
4.Incubateat30°C,230-250rpm,untiltheOD600reaches0.4-0.6(thiscantakebetween4-8h).
5.UseOD600Unitstodeterminethevolumeofeachyeastculturetobetaken;i.e.decidetotake15OD600Unitsofeachculture15/OD600=volumetobetaken,soifOD600=0.5,take30ml
6.Foreachculture,transferthevolumecalculatedaboveintoa50mlFalconhalffilledwithice.Spinat2500rpm(MSE)for5min.
7.PouroffsupernatantandresUSPendpelletinto50mloficecoldH2Oandspinagain.
8.RemovesupernatantandfreezethepelletinliquidN2(cellscanbestoredat-80°C)
9.Justbeforeuse,makeupcompletecrackingbuffer
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