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回复:时间:2017-08-03
构建载体可以丢给我~~~然后可以通过转染载体或者病毒感染的方式,导入你的sh或者过表达,然后用qPCR以及WB分别验证ran水平的干扰效率及蛋白水平的敲降效率。需要注意的是,RNA下降蛋白不一定100%下降。因为最终功能体是蛋白,因此我建议你做WB。如果后续处理时间较长,或者感染效率较低,建议你挑稳转株。如果后续处理时间很短(几天)并且感染效率很高(>80-90%)那就不需要稳转株,直接用这个细胞池就可以。有神马问题可以站短我qq。
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回复:时间:2017-08-02
展开引用王芳媛1991现要针对细胞中的某种抑制蛋白IF1(基因大概300多bp)构建干扰以及过表达的慢病毒载体,如果找公司构建3个干扰的慢病毒,收到之后需要筛选出干扰效率最高的,请问该如何筛选?如何判断其干扰效率?过表达的又该怎么办?做完转染之后,我需要用TNF-α处理细胞,然后检测细胞的增殖、凋亡以及抑制蛋白IF1的表达情况,这样的话我是不是需要构建稳定株?(新手,且无人指导,所以有很多问题)还望有前辈可以多多指点迷津......收到病毒之后感染细胞,感染3-4天收集细胞,进行QPCR检测,挑选干扰效率最高的那个,一般在(70以上),而后使用这个病毒进行实验,在这个同时可以筛选稳定株。过表达感染细胞之后同样操作,检测可以使用QPCR检测或者标签抗体检测,一般QPCR倍数两倍以上。
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