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浅谈实验中BSA的选择
蚂蚁淘
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| 实验材料 | pAS38pAS45pAS47 试剂、试剂盒 | 聚乙二醇（PEG)氯化钠溶液HEPES缓冲液涂布溶液Tris缓冲盐水TBS-Tween-20琼脂糖-磷酸溶液 仪器、耗材 | LBSOCYT
实验步骤 | 3.1实物库构建 我们用Kunkel突变技术构建大多数的实物库虽然我们证明了 AB链套可用来结合目标分子，但多数情况下，我们用FNfn10的“上”端（BC、DE和FG链套；图6.1A)作为目标分子结合位点[10]。我们的方法基于Bio-Rad的Mutagenekit[17]。用大肠杆菌SS320做电转化，可以很容易地制备含有大约109个独立克隆的实物库。  3.1.1尿嘧啶单链噬粒的制备（用于单价噬菌体展示和酵母双杂交筛选) (1)用pAS47、pAS38(用于独体-基因III)或pYT45(用于B42-独体）转化CJ236，在LB-AP平板中选择菌落。 (2)把一菌落接种到2ml2XYT-Ap-氯霉素培养基，37°C摇动过夜。 (3)将30ml补充了0.25μg/ml尿苷的预热2XYT-Ap培养基装入250ml规格带凹陷三角烧瓶，用300μl CJ236过夜培养液接种，再加入1010个/ml辅助噬菌体KO7(Promega)。在强力摇动下于37°C生长2h。加入Km使终浓度达到70μg/ml。在强力摇动下于37°C生长过夜。 (4)于4°C以12000g离心[10000r/min，用SS-34(Sorvall)或等效的转子]10min。将上清液移入新试管，再次以12000g离心10min。将上清液移入新试管。加入4.5mlPEG/NaCl溶液，并彻底混合。4°C保育过夜。 (5)于4°C以17200g离心（12000r/min，SS-34转子）20min。抛弃上清液将试管倒放在一叠纸巾上1min。用纸巾擦去残余液体。 (6)将噬粒沉淀悬浮于1mlTBS中，并移入微离心管。在微型离心机上以最大速度离心2min。将上清液移入新微离心管。加入150μlPEG/NaCl溶液，彻底混合。在冰上保育30min。 (7)在4°C以最大速度离心10min。拋弃上清液，稍加离心，并用移液器除去所有液体。将沉淀悬浮于1mlTBS中。 (8)用XL-1Blue和CJ236测定噬粒浓度。将100μl新鲜大肠杆菌（600nm光密度OD值为0.5~1.0)和10μl系列稀释噬粒溶液混合。室温保育15min，并铺在LB-Ap板上。在37°C保育过夜。用CJ236的滴定值应该是1012~1014个/ml，并且应该比用XL-1Blue的值大104。 (9)用Qiagen单链DNA制备试剂盒制备尿嘧啶单链DNA。 3.1.2尿嘧啶单链噬菌体的制备（用于多价噬菌体展示载体，JCFN) (1)用JCFN质粒转染CJ236。热激之后，与30ml预热的2XYT和500μl新鲜的CJ236(OD600值 0.5~1.0)混合，再于37°C摇动6h。 (2)完成3.1.1节的步骤（4)至（9)。为测定浓度，混合3ml LB和0.7%琼脂糖（熔化后冷却至45°C)，10μl连续稀释的噬粒溶液和100μl新鲜的大肠杆菌。混匀并立即冲入LB平板中。在37°C培养保育过夜并测定滴度。 3.1.3突变寡核苷酸的制备 (1)设计一寡核苷酸，取决于GC含量，使其分别含有大约20和15个碱基的5"或3"补区。我们使用密码NNK和NNS来进行“硬”随机化，其中N代表所有核苷酸的等摩尔混合；K代表G和T的等摩尔混合；S代表G和C的等摩尔混合。 (2)将约10μg溶解于水的粗寡核苷酸做丙烯酰胺凝胶电泳，切出对应于正确分子质量的带，将寡核苷酸用电洗脱（见注3)。 (3)将2μg纯化的寡核苷酸、3μlT4多聚核苷酸激酶缓冲液、5UT4多聚核苷酸激酶（New England Biolabs)、1.5μl10mmol/L腺苷三磷酸混合，加水至30μl。37°C保育2h，然后65°C保育15min。将溶液在一20°C保存。 3.1.4双链DNA合成 (1)混合大约1μg尿嘧啶单链DNA、2μl磷酸化的寡核苷酸（见3.1.3)，1μl10X退火缓冲液（Bio-Rad Metagene kit)，加水使体积达10μl (见注4)。制备一无寡核苷酸的对照反应。 (2)使用聚合酶链反应（PCR)仪，在70°C保温5min，然后以每分钟降1°C的速度，降温至30°C。将试管置于冰上。 (3)在退火混合物中，加入1μl10X合成缓冲液（Bio-Rad Metagene kit)、1μlT4DNA连接酶和1μlT4DNA聚合酶（New England Biolabs)。在冰上和室温相继保温各5min，37°C保温30min，75°C保温15min，然后冷却至室温。将1μl样品通过琼脂糖胶(电泳）。含有寡核苷酸的样品会得到比无核苷酸的对照样品所得分子质量高的产物。 (4)把一滴混合物放在飘在水上的0.025μm透析膜碟上，透析合成混合物1h，然后在新的微离心管中复原透析过的混合物。使用前保存在冰上。 3.1.5电穿孔胜任细胞的制备 (1)在350ml含Tc的超级肉汤中培养大肠杆菌SS-320直至OD600达到0.8。 (2)在冰浴中快速冷却三角瓶中的培养液，然后放置在冰上15min。将培养液移至离心瓶，在0~2°C以3900 g[4700r/min，用JA-10(Beckman)或等效转子]离心5min (见注5)。 (3)撇去上清液，通过在冰上敲击离心管，将细胞悬浮于10mlHEPES缓冲液中。加入390mlHEPES缓冲液，并搅动使细胞悬浮。在0~2°C以3900g离心5min。 (4)撇去上清液。将细胞悬浮于10mlHEPES缓冲液中并将悬浮物移至50ml离心管。用缓冲液漂洗第一个瓶子并在50ml离心管中恢复细胞悬浮。 (5)在0~2°C以4300g(6000r/min，用SS-34转子）离心10min。去上清液。在冰上敲击离心管使细胞悬浮于10ml10%甘油中，然后加入20ml10%甘油，并将离心管颠倒数次以使悬浮物混合。 (6)在0~2°C以4300g离心10min。去上清液。加300μl10%甘油，并在冰上敲击离心管使细胞悬浮。检查体积，加10%甘油使终体积达700μl。将悬浮物等分至两个离心管中（各350μl)。 3.1.6噬粒DNA电穿孔转染 (1)将冷却的DNA[见3.1.4，第（4)步]加入放在微离心管中的350μl电转化感受态细胞中，并在冰上保温5min。将混合物移至预冷的电穿孔试管中（2mm间隙)。 (2)电穿孔细胞，如在2.5kV高压模式下使用BTX ECM395电穿孔器。 (3)立即在试管中加入1mlSOC，并使细胞悬浮。转移细胞至250ml三角瓶。加1mlSOC到试管中，清洗残留细胞并移入三角瓶中。再重复此操作3次。 (4)三角瓶中加入20mlSOC。在37°C以180r/min摇动三角瓶30min。并通过放置部分稀释的悬浮物至LB-Ap平板检查浓度。 (5)将全部悬浮物加至500ml预热的2XYT-Ap中。为酵母双杂交的质粒制备，在37°C摇动过夜并制备质粒。为噬粒制备，加入1010pfu/ml辅助噬菌体KO7，在37°C摇动过夜，并如3.1.1节所述制备噬粒。 为噬菌体DNA的转化，在第（3)步之后，加入1.5ml中对数期SS-320细胞，然后将悬浮物移至预热的120ml2X YT-Tc。按照3.1.2节所述测定噬菌体浓度。37°C保育4h。按照3.1.1节所述制备噬菌体。 3.1.7酵母实物库构建 为酵母双杂交筛选，在大肠杆菌中，我们按照3.1节的描述构建了载体库，然后将这个库引入酵母中。酵母转化系基于Gietz的方法[18]。用这个方法，我们在典型情况下得到约106个独立克隆。 (1)在30°C，20mlYPD中摇动过夜生长酵母EGY48。将培养液加入预热的300mlYPD使OD600值为0.25。让细胞生长直至OD600值接近1。 (2)在室温下以3600g(4500r/min，JA-10转子）离心5min。撇去上清液，并悬浮细胞于300ml灭菌水中。重复离心和悬浮。再离心，悬浮细胞于25ml灭菌水，并移至50ml离心管中。室温以3000g (5000r/min，SS34转子）5min。撇去上清液，并悬浮细胞于1.2ml灭菌水。 (3)将35μl细胞悬浮物放在一边用作负对照。在余下的细胞悬浮物中加入7.2ml50%PEG3350、1.08ml1mol乙酸锂、500μl携带子单链DNA(Origene)、45μgDNA和900μl水。彻底混匀，并每份360μl分装入30个微离心管中。在负对照管中加入1/30除DNA外的上述材料（即PEG、乙酸锂和携带子DNA)，彻底混匀。 (4)在42°C保育40min。在微离心机上以10000r/min转速室温离心10s，撇去上清液。悬浮每管中的细胞于150μl水中。将细胞铺在直径为15cm的筛选平板上（YCGlctrp-)上。30℃保育3d。 (5)每皿加入15ml水，用灭菌的盖玻片刮散所有菌斑。把所有细胞悬浮在500ml离心管中，并以3900g (4700r/min，JA-10转子）离心5min。撇除上清液，悬浮细胞于500ml水中。再次离心并撇除上清液。悬浮细胞于50ml水中，并测量OD600以确定细胞密度（1OD600对应于约2X107个/ml)。加入甘油至终浓度15% (V/V)。分装并保存细胞悬浮物于-80°C。 3.2噬菌体展示库分类 3.2.1扫视（panning) (1)加入50μl涂渍溶液到酶联免疫吸附试验酶标板（NuncMaxisorp，可分小孔，C-bottom)的小孔中（每孔1μg的配体）。把酶标板放入一铺有湿纸巾的密封盒子中。保持盒子在4°C过夜，或37°C1h。 (2)用移液器除去液体，并用水清洗小孔两次。加入360μl含3%BSA的TBS于小孔中。37°C保育1h。为了下一轮实验，制备一对照小孔；加入无配体的缓冲液，并用BSA封闭小孔。 (3)从小孔移除封闭液，用水清洗两次。加入12μl5%BSA溶液和50μl噬菌体悬浮物（1011个/孔）。室温保育2h。 (4)移除噬菌体溶液，然后加入360μlTBST。用吸管上下有力地吸动。等待5min然后移除溶液（第一轮一次，以后每轮5次)。 (5)在小孔中加入50μl含有10μmol/L配体的TBST溶液。37°C保育1h，用吸管上下有力地搅动，回收洗脱物。也可以加50μl酸性洗脱缓冲液到小孔中，室温等待10min。用吸管上下有力地搅动。回收第二次洗脱物到装有3μl2mol/LTris-碱的微离心管中，准备中和。 (6)混合5ml新鲜的XL-1Blue (OD600值为0.5~1；在LB-Tc中生长的）和洗脱的噬菌体。对噬菌体，加入100ml2XYT [和异丙基巯基半乳糖苷（IPTG)直至1mmol/L以得到独体的高产出]，并在剧烈摇动的同时，于37°C保育6h(更长的保育时间可能导致独体基因删除）。加入2XYT后立即按3.1.2节所描述的测定浓度。对噬粒，混合5ml新鲜的XL-1Blue和洗脱的噬粒，37°C保育20min、加入100ml2XYT(以及IPTG，如果需要）、100μg/mlAP以及1010个/ml的辅助噬菌体KO7；在37°C保育2h并保持有力地摇动。Km至终浓度70μg/ml并保育过夜。保育20min后立即按3.1.1节描述测定浓度。按3.1.1和3.1.2节所述，分离噬菌体（或噬粒)。重复整个步骤，直至洗脱的噬菌体（或噬粒）数增加。 3.2.2单噬菌体克隆的鉴定 (1)从单克隆中制备噬菌体（或噬粒)。对噬粒，在2mlLB-Ap上过夜生长一单菌落。混合20μl培养液、2mlLB-Ap (和IPTG，如愿意的话）和1010个/ml辅助噬菌体KO7。37°C剧烈摇动保育过夜。对噬菌体克隆，用灭菌的牙签接触一单菌斑。将牙签放在2ml含100μl新鲜XL-1Blue的LB-Ap(和IPTG，如果需要的话）中，37°C剧烈摇动保育6h。按3.1.1和3.1.2节所述，制备噬菌体（或噬粒)。 (2)对每一个要测试的克隆，完成3.2.1节的第（1)和第（2)步，来准备一带有固定目标分子的小孔。同时用不含目标分子的涂渍溶液涂渍，来制备另一对照用小孔（见注6)。 (3)加入5μl5%BSA溶液和50μl从单克隆制备的噬菌体悬浮液到配体涂溃的和对照的小孔中。视相互作用强弱，调节噬菌体浓度（典型值：每孔108~1011个）。在搅拌器上室温保温2h。 (4)用TBST冲洗5次。用喷水瓶在所有小孔中加入TBST，然后清除液体，将平板翻转面朝下拍在一叠纸巾上。 (5)在每一个孔中，加入50μl抗噬菌体-辣根过氧化物酶的抗体溶液（Phamacia;在TBST:BSA中稀释1:2000)，在搅拌器上室温保温1h。用TBST清洗5次。 (6)加入50μl1stepturbo-TMB(Pierce)，等待约10min直到蓝色显现，并加入50μl2mol/L硫酸以终止反应（使用有滤嘴的枪尖以保护移液器）。用平板读出器测量OD450。选择对配体涂渍的小孔有高亲和力并对对照小孔呈低亲和力的克隆，以备进一步检测（测序、亲和力优化和蛋白质生产）。 3.3酵母双杂交筛选 3.3.1目标（“诱饵”）质粒的制备 在pEG202中克隆诱馆基因，使得诱饵与LexA在同一可读框表达。重要的是确认LexA-诱饵自己不激活报告基因，也不与野生型FNfn10相互作用。用相互作用交配法，这很容易测试[13，19]。 (1)用LexA-诱饵质粒[或pEG202作负对照，pBait(Origene)作正对照]和pSH18-34(β-半乳糖苷酶报告质粒；Origene)转化RFY206，并在YCGlchis-ura-平板上选择。也用pYesTrp2(激活子B42质粒；Invitrogen)、pTarget (正对照；Origene)或pYT45转化EGY48，并在YCGlctrp-平板上选择。 (2)在YCGlchis-ura-平板上两个菌斑的每一个上用LexA质粒和报告质粒上平行划痕。在YCGlc trp-平板用B42质粒以同样的方式划痕。30°C保育两块平板1~2d。 (3)复制两块平板至一YPD平板。从两块板上来的划痕应该互相垂直，以使EGY48细胞和RFY206细胞在交叠处杂交。30°C保育过夜。 (4)将YPD平板复制至YCGlcleu-his-trp-ura、YCGlchis-trp-ura-和 YCGalRafleu-his-trp-ura-平板，并在30°C保育3d。所有杂交细胞应该在YCGlchis-trp-ura-平板上生长。在YCGalRafleu-his-trp-ura-平板上的生长指示“诱饵”和“捕食者”的相互作用。其他平板用于对照。 3.3.2酵母双杂交库筛选 含有诱饵的RFY206与含有独体库的EGY48杂交，并选出含有独体和诱饵的细胞。酵母杂交的应用，使得可以有效地筛选多个库[13]。 (1)在30°C，10mlYCGlchis-ura-培养基中，生长16h驻有pSH18-34和LexA-诱饵质粒的RFY206。 (2)用1.0OD600=2.0X107个细胞/ml换算，通过OD600测定细胞浓度。108个诱饵细胞放在微离心管中以10000r/min的转速在微离心机上离心30s，使细胞旋转沉降，用200μl培养基让细胞悬浮。 (3)加入107个驻有独体的EGY48细胞到诱饵细胞中（见3.1.7)，并在YP平板上铺开。让细胞杂交16h。 (4)用5ml(每次用1ml) YPD培养基将细胞从平板上冲洗下来。100倍稀释后测量OD600，将108个细胞铺在5个YCGal Raf leu-his-trp-ura-培养基平板上。于30°C保育这些平板3~4d。 (5)复制菌落到 YCGal Raf leu-his-trp-ura-培养基平板和YC Galleu-his-trp-ura-培养基平板上。保育16~24h。真的正克隆将只会在YCGal Raf leu-his-trp-ura-平板上生长。 (6)在通风厨内，打开平板盖，加入足够氯仿以覆盖板表面。5min后将氯仿倒入废物罐，并让剩余的氯仿挥发10min[20]。 (7)在微波炉内加热琼脂糖-磷酸盐溶液（每皿10ml)，以溶解琼脂糖，在水浴中冷却到50°C。在试管中加入35μl50mg/ml X-gal溶液和10ml琼脂糖-磷酸盐溶液，搅拌，并倒入平板中。30°C保育。观察颜色。挑出呈现蓝色的克隆以备进一步检验。 3.3.3分离独体的特异性检测 (1)于30°C，在1.5mlYPD培养基中，培养从库中筛选出来的感兴趣的酵母细胞16h，并用Y-DER酵母DNA抽提试剂盒（Pierce)从酵母细胞中制备DNA。 (2)将透析后的酵母DNA用电穿孔注入大肠杆菌KC8细胞（见3.1.4)，并在LB-Ap平板上挑选转化细胞。 (3)在基本trp-Km平板上复制菌落，并于37°C保育。选取两个菌落分别接种于2mlLB-Ap培养基中，于37°C，培养10h，并用标准方法抽提质粒DNA。生长超过10h的KC8细胞常产生不纯的质粒。用标准的DNA测序法测定独体片段的序列（见注7)。 (4)用B42-独体质粒转化EGY48，并用相互作用杂交法测定其与各种诱饵的相互作用（见 3.3.1)。 3.3.4液相β-半乳糖苷酶测试 生化测量之前，诱馆与独体的亲和力可用液相β-半乳糖苷酶测试半定量地加以确定。这个方法比3.3.2小节描述的平板测试更为定量。我们改进了这个方法使之适用于96孔平板格式（见注8)。 (1)用pSH18-34、LexA-诱饵质粒（pEG202的衍生物）和B42独体质粒(pYesTrp2衍生物）转化RFY206酵母菌株。把一个菌落接种至2mlYCGlchis-ura-trp-，于30°C摇动过夜。 (2)稍稍离心以移除培养基，在温热的YCGlchis-ura-trp-中悬浮直至OD600值为0.2。于30°C摇动6h。测定OD600值并以每350μl装入微离心管中。典型地，我们每次测量三遍。 (3)将2Xβ-半乳糖苷酶测试溶液与Y-Per(Pierce)按1:1混合作为工作溶液。加350μl工作溶液到每个样品中。多次翻转以混合。 (4)30°C保育，同时检查颜色。当呈现黄色时，加300μl0.5mol/L碳酸钠入离心管，并彻底混合。以最大速度离心微离心管1min。测定上清液的OD420值。 3.4独体的克隆、表达、纯化和生物素化 当从库中筛选出具有所期望特性的独体后，其基因转染至大肠杆菌表达载体，独体则被表达纯化为一分离的蛋白质。我们在典型情况下每升培养液得到10~15mg独体。我们也描述了为在免疫化学应用中便于探测而使独体生物素化的操作步骤。 3.4.1独体的克隆 用寡核苷酸NdeMetThrFNF(5"-CGGGATCCCATATGCAGGTTTCTGATGTTCCGACCGACCTGGAAGTTGTTGCTG-3"；它包含 Arg6到Thr的突变）和FNGKKGKR(5’-CCGACTCGAGTTACTATTTACCTTTTTTACCGGTACGGTAGTTAATCGAG-3"），扩增感兴趣的独体基因，然后用NdeI和XhoI降解并克隆到用同样的酶降解过的pET15b(Novagen)中。通过测序确认表达载体中基因。 3.4.2独体的表达 此操作步骤适合于100ml培养液，对初步鉴定而言，这样的量应该能产生足够的独体。 (1)用独体表达载体转化BL21(DE3)细胞（Novagen)(见注9)。 (2)接种转化细胞至10mlM9-胰蛋白胨-Ap，并在强烈摇动下，于30°C保育10~16h。 (3)接种2ml预培养液至预热的100mlM9-胰蛋白胨-Ap，并在强烈摇动下于37°C保育。当OD600值达到0.7时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L。 (4)在强烈摇动下于37°C保育3h多，并离心收集细胞。细胞可存储于-20°C，直至使用。 3.4.3独体的纯化 此操作步骤适合于100ml培养液（见3.4.2)。 (1)悬浮细胞沉淀于6.4mlpH8.0的50mmol/LTris-氯化氢中。 (2)加入64μl 50mg/ml溶菌酶和128μl50mmol/LPMSF。混合并于37°C保育15min。超声破碎并悬浮直至不再有高度黏滞性。 (3)加入910μl40mol/L氯化钠。于4°C以27000g(15000r/min，SS34转子）离心10min。收集上清液。 (4)将蛋白质溶液放入装载了 0.1mol/L氯化镍并用缓冲液B平衡过的Hi-Trap螯合柱中（1ml；Amersham-PharmaciaBiotech)。先用 6ml缓冲液B，再用 6ml含60mmol/L咪唑的缓冲液B洗柱。 (5)用6ml缓冲液C洗脱独体。收集0.5~1ml每份的洗脱液到微离心管中。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析洗脱液。 3.4.4独体的生物素化 我们连接生物素到Lys的氨基。这虽然不是位点特异的，但在C端的扩展部分成团的Lys应该是最易发生的修饰位点。这个方法可用来连接其他的片段，如荧光染料。 (1)完成3.43小节中纯化操作的步骤（1)~(4)。 (2)用10ml缓冲液D清洗柱子。 (3)溶解1mgD-生物素-ε-氨基己酸轻基琥拍酰亚胺脂（BoehringerMannheim)于50μl二甲基亚砜，并将其稀释至3ml缓冲液D中。注射1ml溶液到柱中并于室温黑暗中保温1h。再重复反应2次。 (4)用6ml缓冲液B洗柱，并按3.4.3节第（5)步所述洗脱独体。
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