2021-07-21【求助】生物素标记探针筛选cDNA文库是否可行本周推荐讨论贴，加分从优。

看起来不错，不过没用过，也不熟悉

其它都好理解，只是搞不懂包被RecA和重组酶的作用是什么？感觉有点多余，不用它也应该可以的，类似的实验有很多。不知道是不是可能ActiveMotif公司为了避开别人的专利才搞这么玄乎？请高人指教！如果不用RecA，试剂自己单独购买，应该能节约不少银子，还可练手。

抛砖引玉。我先来讲一些基础的，大家补充。先说一下recA重组酶和recA同源重组系统。理解了recA重组酶的作用，就好理解这个kit的原理和操作方法了。那么就晓得能不能改进和DIY了。嘿嘿，按mylab战友的说法，可以单独购买试剂节约银子了。recA介导的同源重组是原核生物DNA修复功能的主要执行者。recA蛋白是一个39ku的单链蛋白，其主要作用是促进DNA同源片段的配对以及DNA分子间的单链交换，并形成稳定的重组产物。但对于加与反应的底物DNA分子具备在个条件：1，DNA分子间或分子内存在较高的同源序列，2，至少一种DNA底物是单链，3，至少一条DNA链具有自由末端。在中性pH条件下，recA能大量结合于单链DNA，每个单体与单链DNA上的3-5个碱基结合，而且这种结合作用呈现高度的协同效应。此外，recA还具有依赖pH和ATP的双链DNA结合活性。TheRecAproteinusedintheRecActiveKitisamulti-functionalE.coliDNA-bindingproteinthatplaysintegralrolesinbothhomologousrecombinationandpost-replicativeDNArepair.RecAcatalyzesthepairingofsingle-strandedDNA(ssDNA)withcomplementaryregionsofdouble-strandedDNA(dsDNA).RecAmonomersfirstpolymerizetoformahelicalfilamentaroundssDNA.DuplexDNAthenbindstothepolymer.BounddsDNApartiallyunwindstofacilitatebasepairingbetweenssDNAandduplexedDNA.OncessDNAhashybridizedtoaregionofdsDNA,theduplexedDNAfurtherunwindstoallowforbranchmigration.RecAhasabindingsiteforATP,thehydrolysisofwhichisrequiredforreleaseoftheDNAstrandsfromRecAfilaments.如果没有recA蛋白，探针杂交可以执行，但就达不到“Theuseofhomologousrecombinationenzymesandkineticallytrappedmulti-strandedDNAhybridsenablesDNAtobetargetedinitsnatural,non-denatured,double-strandedstateatvirtuallyanyDNAsequence”的效果了。变性转移到纤维素膜上的的全长CDNA怎么还能进行后续的转化、克隆实验呢？嘿嘿，看来，这个东东还是要保留的。有兴趣的战友再看看这个protocol吧。recActive.rar(277.48k)

感谢raimi版主的指教。看来用recA的确是不错的主意。不过，我以前实验室还用过更简洁的方法（我自己没做这个实验，大概步骤如下）：1.PCR标记Biotin探针，相同。2.过量探针与文库DNA混合，变性、退火（与一个PCR循环类似，但时间长一些）。3.用亲合素包被的磁珠富积。交换液体。4.去掉磁场。5.将富积产物高温变性。保持高温加磁场。6.取出的液体即为你需要的东东。两个高温变性就可以解决问题，效果还不错。完全可以DIY的。

mylab实验室使用的方法应该是用于富集筛选SSR引物的一种方法，但是真正要用于筛同源基因则可能不太适合。目前我们实验室正在使用ActiveMotif的试剂盒筛选基因组文库，似乎效果不错。

请问天阶小雨这种试剂盒好像已经停产了，你是从哪个公司买的？是不是宝生物？

我准备进行的试验设计基本路线同本贴，但是我是用生物素标记的短肽从CDNA文库中筛选基因，请教是否可行？

请问ActiveMotif公司的试剂盒是不是停产了，哪位师兄（姐）知道还有那个公司生产相关的试剂盒？