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蛋白定量技术
蚂蚁淘
/发布时间:1545759556 /浏览量:41
（一）双缩脲测定法
1．原理蛋白质中的肽键有双缩脲反应，在碱性溶液中与二价铜离子形成蓝紫色的络合物，在一定的范围内，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。此法特异性强，游离的氨基酸、小肽和核酸均不产生这种反应，但此法不够敏感，仅能测出毫克水平。
2．试剂配制
硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.50g
酒石酸钾钠5.00g
H2O500.0ml
10％氢氧化钠（不含硫酸钠）300ml
H2O加至1000ml
此溶液可长期保存，如产生暗红色沉淀，则应废弃重配。
3．标准曲线的制备
⑵将1％的牛血清白蛋白按表8-1进行稀释：
表8-1牛血清白蛋白稀释方法表
成分 | 试管号 | ||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
1％蛋白液（ml） | 1.0 | .09 | 0.8 | 0.7 | 0.6 | 0.5 | 0.4 | 0.3 | 0.2 | 0.1 | － |
蛋白含量（mg） | 10 | 9 | 8 | 7 | 6 | 5 | 4 | 3 | 2 | 1 | － |
生理盐水（ml） | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.9 | 1.0 | 1.1 | 1.2 | 1.3 | 1.4 | 1.5 |
双缩脲试剂（ml） | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
试剂蛋白含量（mg） | 8.0 | 7.2 | 6.4 | 5.6 | 4.8 | 4.0 | 3.2 | 2.4 | 1.6 | 0.8 | 0 |
注：1％牛血清白蛋白，经凯氏定氮测定含纯蛋白为80％。
⑶混匀后于室温放置0.5h～1h，光电比色（540nm），顺序由低浓度至高浓度，每管测3次，求其平均值。
⑷以OD值为纵坐标，蛋白含量为横坐标绘制标准曲线。
4．样品测定
⑴取样品0.1ml，加生理盐水1.4ml。也可将样品做1﹕10稀释加1ml，再加生理盐水0.5ml。
⑵加双缩脲试剂4.0ml，混匀，至室温0.5h～1h。
⑶另以1.5ml生理盐水加4.0ml双缩脲试剂作为空白对照。
⑷测OD540值。
⑸根据OD值从标准曲线上查出蛋白含量。
注意：各种双缩脲试剂的配法、加量及室温静置时间均有差异，一旦标准曲线制定后，样品的测定则必须与标准曲线制定的条件一致，否则结果有差异。
（二）紫外光谱吸收法
1．原理本法根据蛋白之中的芳香族氨基酸－色氨酸、酪氨酸在紫外光区的吸收特点而建立的。蛋白质在280nm波长附近有一吸收峰，其吸收程度与这些氨基酸的含量成正比。此法灵敏度高，可测到微克水平，操作简单，不需要加各种试剂，测完后，样品可回收。
2．标准曲线的制备
⑴用精密天平称取牛血清白蛋白50mg，溶于50ml生理盐水中。
⑵以生理盐水再稀释成每ml含0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg……0.9mg，以盐水对照。
⑶测各管OD280值。
⑷以OD280值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
3．样品测定
将待测样品以盐水适当稀释，在0.10mg/ml~1.00mg/ml之间，以生理盐水为对照，测OD280值，从标准曲线上查出蛋白含量。
（三）Folin酚法
1．原理蛋白质中的酪氨酸与色氨酸和Folin酚试剂中的磷钨酸、磷钼酸作用后，在碱性条件下不稳定，被还原成蓝色的化合物（钼蓝）。因此通过比色即可测知标本中的蛋白含量。该法的优点是操作简单、灵敏度高，且不受溶液中脂多糖的干扰。
2．试剂
试剂甲：
A液：Na2CO310.00g
NaOH2.00g
酒石酸钾钠（或钾盐钠盐）0.25g
混合、溶于500ml蒸馏水中。
B液：CuSO4·5H2O0.5g
H2O100.00ml
用前将A液50份与B液1份混合即为试剂甲。
试剂乙：
于磨口回流瓶加入下列试剂
Na2WO4·2H2O100.00g
NaMoO4·2H2O25.00g
H2O700.00ml
85％H3PO450.00ml
浓HCl100.00ml
按上回流冷凝管以小火回流10h后再加：
硫酸锂150.00g
H2O50.00ml
溴水数滴
开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色微带绿色（如仍呈绿色，须重复滴加液体溴步骤）。稀释至1L，过滤，滤液置于棕色瓶保存。使用时用标准NaOH液滴定，以酚酞为指示剂，然后适当稀释（加水约1倍）使最终浓度为1mol/L。
3．标准曲线的制备
⑴取标准牛血清白蛋白2.50mg，溶于10ml蒸馏水中，使成250μg/ml。
⑵按表8-2稀释。
表8-2标准曲线稀释方法
成分 | 试管号 | ||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
牛血清白蛋白标准品（ml） | 0 | 0.2 | 0.2 | 0.4 | 0.1 | 0.6 | 0.6 | 0.8 | 0.8 | 1.0 | 1.0 |
生理盐水（ml） | 1.0 | 0.8 | 0.8 | 0.6 | 0.6 | 0.4 | 0.4 | 0.2 | 0.2 | 0 | 0 |
蛋白含量(μg／ml) | 0 | 50 | 50 | 100 | 100 | 150 | 150 | 200 | 200 | 250 | 250 |
⑶每管加试剂甲5ml，混合后室温放置10min，再加0.50ml试剂乙（即Folin酚试剂），立即摇匀（否则显色降低）。
⑷30min后测OD650nm。
⑸以OD为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
4．样品测定
⑴待测样品1ml（适当稀释至约含25μg－250μg/ml）。
⑵加试剂甲、乙。
⑶比色、测OD650值。
⑷查标准曲线，求蛋白含量乘以稀释倍数，即为样品的蛋白含量。
（四）紫外分光测定法
A1%1cm＝13.8（IgG）(280nm)
A1%1cm＝14.5(IgM)(280nm)
蛋白质浓度（mg/ml）=1.45OD280－0.74OD260（此为经验公式，即以不同浓度的蛋白质和核酸混合测定的数值所建立的）。
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