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凝集素亲和层析法纯化蛋白质实验一刀豆素 A 亲和柱纯化蛋白质
蚂蚁淘
/发布时间:1627407002 /浏览量:248
| 实验方法原理 | 用于亲和层析的凝集素应根据它们结合的特异性和紧密度加以选择。例如，刀豆素A（ConA）与糖蛋白含有的葡萄糖或甘露糖结合，而麦芽凝集素只与具N-乙酰葡糖胺的蛋白质结合。胞膜糖蛋白常与麦芽凝集素结合，而可溶性糖蛋白却通常用ConA或扁豆凝集素亲和柱纯化。由于在许多情况下被纯化的糖蛋白的结构和特性不清楚，所以筛选一些凝集素与目的蛋白的结合状况常常是有用和必要的。用于此目的的凝集素试剂盒也可购得。 凝集素亲和层析相对易于操作。可用许多方法将凝集素固相化到介质。溴化氰偶联是普遍采用的方法。每ml介质材料能偶联凝集素。偶联时含有适宜的二价离子（0.1mmol／L）和保护性糖类（5％，w／v）是关键。保护性糖类在偶联过程中使结合部位不易接近而受到保护。许多凝集素亲和柱也可从市场购得。 以下步骤以介绍刀豆素A亲和柱纯化蛋白质为例，其他凝集素亲和柱的纯化步骤基本相似，只要换成适宜的洗脱用糖。相对长而细的层析柱有更好的分辨率，短而粗的柱子在小体积洗脱时具有更快的流速。小的试验柱（例如装填在巴斯德吸管内的）或在小离心管内进行的层析试验可用于估算柱的结合容量。 | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 糖蛋白样品液 试剂、试剂盒 | 甲基-α-D-甘露糖NaClNaN3Tris-HClNaClMncl2CaCl2辛糖苷 仪器、耗材 | 层析柱
实验步骤 | 1.制备刀豆素A亲和柱； 2.用10倍柱体积的层析缓冲液（20mmol／L，pH8.0Tris-HCl，0.15mol／LNaCl，1mmol／LMnCl2，1mmol／LCaCl2，30mmol／L辛糖苷）平衡装好的亲和柱； 3.糖蛋白样品液对层析缓冲液透析或用该缓冲液1：1稀释，然后离心或过滤除去沉淀； 4.将调整好的糖蛋白样品液上样到亲和柱； 5.用层析缓冲液洗柱至A280值回到基线； 6.用5倍柱体积含10mmol／L甲基-α-D-甘露糖的层析缓冲液洗脱； 7.继续分别用5倍柱体积含20、50、100、250和500mmol／L甲基-α-D-甘露糖的层析缓冲液洗脱； 8.检测目的蛋白组分。汇集的目的蛋白组分透析除去糖； 9.用含1mol／LNaCl的层析缓冲液洗柱，以获得再生； 10.欲储存时，用含0.02％NaN3的层析缓冲液洗柱，肪止污染。 注意事项 | 一些凝集素在它们的结构整合中需要某些二价离子。因为凝集素亲和层析常常涉及膜蛋白质，故经常需要去垢剂以保持这些蛋白质的可溶性。虽然凝集素对非离子型去垢剂相当宽容，但是离子型去垢剂减少它们的特异结合。 其他 |
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