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2008-12-04【求助】[求助] 溶菌酶破碎大肠杆菌

badigo
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我打算做蛋白提取，以前单纯用超声效果不好，为了尽量保留活性，选择用溶菌酶见超声破碎的方法。
我按照分子克隆上的步骤：
1.菌体称重为0.4g，加PBSbuffer3ml（PH=8.05），充分混匀。
2.加现配的50mg/ml溶菌酶溶液240微升，至终浓度4mg/ml。冰置3小时。
3.超声400w，10s，10s，40次，结果目测还是乳白色，镜检很多菌体。

为什么破不开，搞不懂，我前几天做预实验的时候，还能变澄清？？？
注：预实验的步骤与现在的一样，只是菌体重量是0.1g加PBS3ml，再加溶菌酶至1mg/ml，超声400w，10s,10s,20次。

麻烦大家能给以帮助，先谢谢了...
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回复：时间：2008-12-11

破菌时，不要太在意所谓的乳白色、澄清之类的东东，也不要过分相信镜检。简单的方法就是电泳，破菌离心后做个上清和沉淀的电泳就行了。我们一般破菌（E.coli.），就是1g菌加10-20ml缓冲液，冰水浴超声4s/4s，400-500W，99次*2，就可以了。你的溶菌酶加得太多了吧，我不知道具体用量，但4mg/ml肯定是过了。从纯化的角度看，加入了这么多杂蛋白，不可思议。

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