2021-07-22【共享】快速细胞破碎法鉴定转化子DNA

首先说明，因为最近有人向我要，我以前也发过，好像是试剂配方不全，所以在此补发一个，望版主不要删了！多谢！

快速细胞破碎法鉴定转化子DNA（分离效果一般，二者要相差比较大才行，我常用前者，一般T载体上的要五百bp以上，一千bp以上最好！）
快速细胞破碎法鉴定转化子DNA

1、转化子菌落接种于相应的抗性培养基2.0ml，过夜培养。（要求设立对照！）
2、制备0.8%琼脂糖胶。
3、取1.5ml过夜培养物离心，15kr/min，1min；弃上清。（剩余保种！）
4、加水重悬，离心如上。留沉淀。
5、每管加50—100µl破碎细胞缓冲液(见后配方)，充分涡旋，使菌体悬浮均匀
6、水浴37℃，15min。
7、离心15kr/min，15min。
8、立即取20-30µl上清点样进行电泳，4—6V/cm。
9、电泳，当溴酚蓝到达凝胶板的2/3时，停止电泳。
10、染胶15—30min。
配方：50mMTris-HCl(pH6.8)；1%SDS；2mMEDTA；400mM蔗糖；0.01%溴酚兰
配法：1MTris-HCl(pH6.8),10ml;20%SDS,10ml;250mMEDTA,1.6ml;蔗糖27.2g;1.2%溴酚兰1.67ml加水至200ml;

煮沸法快速分析转化子DNA

1、挑单菌落于2.0ml相应抗生素液体培养基中，37℃振荡过夜（约16小时）。
2、取1.5ml过夜培养物于离心管中，15kr/min，1min。（剩余保种！）
3、弃上清，倒扣、流尽。
4、加入350µl由下列试剂组成溶液，混匀。
(8%蔗糖、0.5%TritonX-100、50mMEDTA(pH8.0)、10mMTris-HCl(pH8.0))
5、加入25µl新鲜配制的10mg/ml的溶菌酶（溶于10mMTris-HClpH8.0中），涡旋3--5sec。
6、立即将离心管浸入沸水浴40sec。
7、离心15kr/min，10min。
8、转移上清至另一离心管，加入2.5MNaAc40µl，加入异丙醇420µl，混匀后冰浴15min，沉淀DNA。
9、离心15kr/min，15min，将上层异丙醇弃去，真空抽干。
10、加入50µlTE缓冲液重悬，（含Rnase50µg/ml）。37℃保温10min。
11、取10µl样品点样，电泳，染胶。观察质粒DNA的区带位置。（要求有对照电泳！）