2016-11-28单个核细胞细胞分离

蛋白？

分得不好，这个分离液质量重要，手法要好，离心机减速要平稳，正常是界限很清楚的一层。

如果手法操作好的话，应该就是分离液的问题，我昨天刚用两瓶分离液试过，一瓶效果很好分界明显，一瓶就是像...

有几个地方可以探讨一下：1.灌注流向：我们是下腔静脉进针，门静脉剪开。灌注液从下腔静脉进，门静脉出。下腔静脉比门静脉粗，有利于充盈。2.我们用的是四型胶原酶，0.1mg/ml，但是总量有200-300ml，整个消化过程将持续1个小时以上，灌注速度2-3ml/min.3.剪下肝脏后为何用预冷的培养基？灌注液37度，培养基4度，这个温差对细胞的刺激非常大。培养基也应预热至37度。4.消化成功的肝脏组织，机械分离时不需要用什么力气。镊子夹住，培养基里抖一下，细胞就能下来。然后移液枪轻轻吹打几下即可。5.铺板4-6小时后，换一下液。另外附上参考文献一篇，里面有相关试剂的配置浓度。ALDH2(E487K)mutationincreasesproteinturnoverand.pdf(1205.48k)

有几个地方可以探讨一下：1.灌注流向：我们是下腔静脉进针，门静脉剪开。灌注液从下腔静脉进，门静脉出。下腔静脉比门静脉粗，有利于充盈。2.我们用的是四型胶原酶，0.1mg/ml，但是总量有200-300ml，整个消化过程将持续1个小时以上，灌注速度2-3ml/min.3.剪下肝脏后为何用预冷的培养基？灌注液37度，培养基4度，这个温差对细胞的刺激非常大。培养基也应预热至37度。4.消化成功的肝脏组织，机械分离时不需要用什么力气。镊子夹住，培养基里抖一下，细胞就能下来。然后移液枪轻轻吹打几下即可。5.铺板4-6小时后，换一下液。另外附上参考文献一篇，里面有相关试剂的配置浓度。ALDH2(E487K)mutationincreasesproteinturnoverand.pdf(1205.48k)

展开引用首先非常感谢您的回复！以下还有几点希望与您讨论！1.关于灌注方向，我准备按照您的方向试一下，门静脉穿刺确实很不稳定；2.您们用的是0.01%的胶原酶，请问是什么牌子的，可否提供下货号；3.是直接用除胶原酶外的消化液直接溶解胶原酶粉是吗；4.整个过程持续一个小时的话，那您们是用什么针穿刺血管并且固定的呢（一个小时如果一直用手把着是不是太不稳定而且劳累了呢）；5.培养基温度也准备用37度的试一下；我消化的肝脏可以看到mushy的感觉，但并不是每一叶都是一点即破，消化成都感觉不尽相同，这是由于穿刺针（我用的24G留置针软针管灌注）进入血管太深导致的吗，还是什么原因呢？6.取下的肝脏里面仍然有需要用镊子撕扯的结缔组织，这是否说明消化并不完全？加大浓度或消化液关灌注量时又怕被过度消化而导致细胞死亡，关于这一点，请问有什么好建议吗？7.抖落的肝脏细胞不离心直接染色观察，会发现大部分为死细胞，请问这是正常的吗？（此时镜下观察应该是什么样的呢）（为什么会有很多死细胞）这种情况在完成细胞离心及密度分离之后，得到改善，镜下活细胞比例增加。期待回复~~bighead1985有几个地方可以探讨一下：1.灌注流向：我们是下腔静脉进针，门静脉剪开。灌注液从下腔静脉进，门静脉出。下腔静脉比门静脉粗，有利于充盈。2.我们用的是四型胶原酶，0.1mg/ml，但是总量有200-300ml，整个消化过程将持续1个小时以上，灌注速度2-3ml/min.3.剪下肝脏后为何用预冷的培养基？灌注液37度，培养基4度，这个温差对细胞的刺激非常大。培养基也应预热至37度。4.消化成功的肝脏组织，机械分离时不需要用什么力气。镊子夹住，培养基里抖一下，细胞就能下来。然后移液枪轻轻吹打几下即可。5.铺板4-6小时后，换一下液。另外附上参考文献一篇，里面有相关试剂的配置浓度。......

在肝细胞分离技术中，有哪些地方是需要十分小心注意的？

不要沉啊望有经验的scholars给予指导!!

chenmo212003胶原酶是sigma的，货号我得查一下，很久之前做的了。灌注期间不需要手一直扶着，从下腔静脉进针后，用缝合线结扎，固定。肝叶消化效果不同是灌注的问题。改变灌注方向后应该可以改善。

我们灌注方法也是下腔静脉进针，剪断门静脉。所有试剂都是预热或者室温状态。胶原酶选用的是sigma的C5138，灌注时间大概一刻钟就可以了，可能我们的酶浓度比较高，120ml60mg。个人感觉没必要用棉棒按压，过程当中可以感觉肝脏明显变大变黄白。所用手术器械酒精擦拭消毒即可。Percoll密度离心之后下层细胞存活率很高。

bighead1985胶原酶是sigma的，货号我得查一下，很久之前做的了。灌注期间不需要手一直扶着，从下腔静脉进针后，用缝合线结扎，固定。肝叶消化效果不同是灌注的问题。改变灌注方向后应该可以改善。请问只考虑perfusion和isolation而不算culture的话，灌注液、消化液、洗液中需要加入glucose或BSA等用来营养细胞吗？

展开引用soochowsugus我们灌注方法也是下腔静脉进针，剪断门静脉。所有试剂都是预热或者室温状态。胶原酶选用的是sigma的C5138，灌注时间大概一刻钟就可以了，可能我们的酶浓度比较高，120ml60mg。个人感觉没必要用棉棒按压，过程当中可以感觉肝脏明显变大变黄白。所用手术器械酒精擦拭消毒即可。Percoll密度离心之后下层细胞存活率很高。......感谢回复！看来胶原酶0.05%这个浓度是比较普遍的，灌120ml会不会略多，主要是担心肝细胞在长时间灌注的情况下会不会缺氧，我看有的文献说最好给予5%O2和95%CO2的通气，想问一下这一步很重要吗（实验条件有限，弄这个会很麻烦）？另外，您的灌注速度是多少呢，120ml的胶原酶消化液灌注到50ml时，可以看到肝脏是个什么状态呢？因为我之前没接触过胶原酶等酶类实验，所以也不太清楚消化的比较好（所谓的mushy）是什么样子，消化过度又是啥样子。另外，percoll这步对于活细胞纯化来说是不是很关键，跟单纯的慢低速离心相比，效果如何？

展开引用chenmo212003感谢回复！看来胶原酶0.05%这个浓度是比较普遍的，灌120ml会不会略多，主要是担心肝细胞在长时间灌注的情况下会不会缺氧，我看有的文献说最好给予5%O2和95%CO2的通气，想问一下这一步很重要吗（实验条件有限，弄这个会很麻烦）？另外，您的灌注速度是多少呢，120ml的胶原酶消化液灌注到50ml时，可以看到肝脏是个什么状态呢？因为我之前没接触过胶原酶等酶类实验，所以也不太清楚消化的比较好（所谓的mushy）是什么样子，消化过度又是啥样子。另外，percoll这步对于活细胞纯化来说是不是很关键，跟单纯的慢低速离心相比，效果如何？......我们配制的时候是120ml每次，灌注的时候每只20ml就足够了。时间长了确实对最后的细胞存活影响挺大的。灌注速度大概是0.35-0.4ml/min，一般灌注液到10ml的时候，肝脏会逐渐变大变黄，和灌注液差不多颜色，肉眼很清楚的。Percoll这步可以很大程度上去除死细胞，离心之后都会在液体上层。一般灌注好的情况下，再悬浮下层细胞，死细胞很少很少。

展开引用兰达斯卡我们配制的时候是120ml每次，灌注的时候每只20ml就足够了。时间长了确实对最后的细胞存活影响挺大的。灌注速度大概是0.35-0.4ml/min，一般灌注液到10ml的时候，肝脏会逐渐变大变黄，和灌注液差不多颜色，肉眼很清楚的。Percoll这步可以很大程度上去除死细胞，离心之后都会在液体上层。一般灌注好的情况下，再悬浮下层细胞，死细胞很少很少。0.35-0.4ml/min的速度，那一次20分钟需要灌注四五十分钟，您确定是这么低的流速吗...（好震惊）这么久的灌注时间会不会导致细胞缺氧严重呢？那看来percoll这步真的非常重要啊，我买的试剂还没到，到了赶紧试一下，请问一下是用的多大百分比（多少毫升）的percoll，用什么溶液配制呢，配置好的分离液和加进来的细胞液是mix在一起吗（还是细胞加在percoll液上层）？问题略多，非常感谢！！......

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chenmo212003机器上设置的是0.4ml/min，实际上我觉得远远要快，因为一般五六分钟就可以消耗差不多十几毫升了。我们用的是50%的Percoll终浓度，预先和所用的media混匀配制而成。细胞用相同体积悬浮缓慢加到上层，即刻离心。死细胞都存在于上层，下层染色死细胞见的很少。

展开引用兰达斯卡机器上设置的是0.4ml/min，实际上我觉得远远要快，因为一般五六分钟就可以消耗差不多十几毫升了。我们用的是50%的Percoll终浓度，预先和所用的media混匀配制而成。细胞用相同体积悬浮缓慢加到上层，即刻离心。死细胞都存在于上层，下层染色死细胞见的很少。......非常感谢您的回复，非常有用！

展开引用bighead1985有几个地方可以探讨一下：1.灌注流向：我们是下腔静脉进针，门静脉剪开。灌注液从下腔静脉进，门静脉出。下腔静脉比门静脉粗，有利于充盈。2.我们用的是四型胶原酶，0.1mg/ml，但是总量有200-300ml，整个消化过程将持续1个小时以上，灌注速度2-3ml/min.3.剪下肝脏后为何用预冷的培养基？灌注液37度，培养基4度，这个温差对细胞的刺激非常大。培养基也应预热至37度。4.消化成功的肝脏组织，机械分离时不需要用什么力气。镊子夹住，培养基里抖一下，细胞就能下来。然后移液枪轻轻吹打几下即可。5.铺板4-6小时后，换一下液。另外附上参考文献一篇，里面有相关试剂的配置浓度。......非常感谢您的答案，今天我最后加了50%percoll，平速离心，发现效果很好，90%的活细胞率了。看来之前的问题可能并不完全是灌注分离的不好，而是肝细胞的提纯没有做好。虽然我的问题不出在您提出的这几点中，但也深受启发，打赏给您8个蚁豆，以表感谢！

展开引用兰达斯卡机器上设置的是0.4ml/min，实际上我觉得远远要快，因为一般五六分钟就可以消耗差不多十几毫升了。我们用的是50%的Percoll终浓度，预先和所用的media混匀配制而成。细胞用相同体积悬浮缓慢加到上层，即刻离心。死细胞都存在于上层，下层染色死细胞见的很少。......想再请教一下，一只8周龄约20-25g左右的普通小鼠（如B6）,最后大约可以分得多少活肝细胞呢？

bighead1985胶原酶是sigma的，货号我得查一下，很久之前做的了。灌注期间不需要手一直扶着，从下腔静脉进针后，用缝合线结扎，固定。肝叶消化效果不同是灌注的问题。改变灌注方向后应该可以改善。麻烦再请教一下，一只8周龄约20-25g左右的普通小鼠（如B6）,最后大约可以分得的活肝细胞数是多少呢？

chenmo212003麻烦再请教一下，一只8周龄约20-25g左右的普通小鼠（如B6）,最后大约可以分得的活肝细胞数是多少呢？这个真没仔细算过，我们铺六孔板，每孔1.5*10的6次方个细胞。反正能铺好几板，最后还要扔掉很多细胞。

小白想问一下这样提取的细胞是肝实质细胞（hepatocyte）还是实质和非实质都有呢？

6.取下的肝脏里面仍然有需要用镊子撕扯的结缔组织，这是否说明消化并不完全？加大浓度或消化液关灌注量时又怕被过度消化而导致细胞死亡，关于这一点，请问有什么好建议吗？

展开引用bighead1985有几个地方可以探讨一下：1.灌注流向：我们是下腔静脉进针，门静脉剪开。灌注液从下腔静脉进，门静脉出。下腔静脉比门静脉粗，有利于充盈。2.我们用的是四型胶原酶，0.1mg/ml，但是总量有200-300ml，整个消化过程将持续1个小时以上，灌注速度2-3ml/min.3.剪下肝脏后为何用预冷的培养基？灌注液37度，培养基4度，这个温差对细胞的刺激非常大。培养基也应预热至37度。4.消化成功的肝脏组织，机械分离时不需要用什么力气。镊子夹住，培养基里抖一下，细胞就能下来。然后移液枪轻轻吹打几下即可。5.铺板4-6小时后，换一下液。另外附上参考文献一篇，里面有相关试剂的配置浓度。......请问一下前辈是拎起肝脏在皿里抖吗？像漂洗那样？