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Preparation of nuclear extract and cytoplasmic extract
Solutions:
BufferA(HypotonicBuffer):1L10mMHEPESpH7.910ml1MHEPES,pH7.91.5mMMgCl21.5ml1MMgCl210mMKCl3.33ml3MKCl0.5mMDTT500µl1MDTT0.2mMPMSF1ml0.2MPMSF
BufferB(S100extractionbuffer):500ml0.3MHEPESpH7.9150ml1MHEPES,pH7.91.4MKCl233.3ml3MKCl30mMMgCl215ml1MMgCl2LowSaltBuffer:1L20mMHEPESpH7.920ml1MHEPES,pH7.925%Glycerol250mlGlycerol20mMKCl6.67ml3MKCl1.5mMMgCl21.5ml1MMgCl20.2mMEDTA400µl0.5MEDTA0.5mMDTT500µl1MDTT0.2mMPMSF1ml0.2MPMSF
HighSaltBuffer:1L20mMHEPESpH7.920ml1MHEPES,pH7.925%Glycerol250mlGlycerol1.2MKCl400ml3MKCl1.5mMMgCl21.5ml1MMgCl20.2mMEDTA400µl0.5MEDTA0.5mMDTT500µl1MDTT0.2mMPMSF1ml0.2MPMSF
BufferD(DialysisBuffer):For2L20mMHEPES,pH7.91MHEPES7.940ml20%GlycerolGlycerol400ml100mMKCl3MKCl66.67ml0.2mMEDTA0.5MEDTA800µl0.5mMDTT1MDTT1ml0.2mMPMSF0.2MPMSF2ml
SplicingExtractPreparation
1.ResUSPendcellpelletin~5packedcellvolumesofcoldPBS.Splitintoadditional250mlconicaltubesifnecessary.Spinat1500rpmfor10minutesinJ-6.
2.Resuspendthewashedcellpelletin5packedcellvolumesBufferA(HypotonicBuffer).Spinat1500rpmfor5minutesinJ-6.
3.AddBufferAuptoafinalof3originalpackedcellvolumes(i.e.,add~2volumes[donotexceedatotalof3volumes]).Incubateonicefor10minutes.
4.TransferthecellstoaWheatonADouncehomogenizerandlysewith~10strokes.StainanaliquotwithTrypanBlueandcheckfor>90%lysisonmicrosope.
5.Spinat2000rpmfor15minutesinJ-6topelletnuclei.
6.SavethesupernatantforS100extract(seebelow).
7.Transferthenuclearpellettoaglassbeakercontainingastirbarandadd1/2packednuclearvolumeofLowSaltBuffer.
8.Whilestirringgently,add1/2packednuclearvolumeofHighSaltBuffer(1.2MKCl).HomogenizeinDounceifnecessary.
9.Stirfor30minutesincoldroom.
10.Transferthenuclearextractto30mlCorextubesandspinat10,000rpmfor30minutesinHB-4rotorat4°C.
11.Removethesupernatantanddialyzefor~2hoursin>50volumesBufferDincoldroom.Changebufferanddialyzeagainst>50volumesfor~2.5hours.
12.Transferto30mlCorextubesandspinat10,000rpmfor20-30minutesinHB-4rotorat4°C.
13.Aliquotin1mlaliquotsandfreezeinliquidnitrogen.Storeat-80°C.
S100extract
A.Mixcytoplasmicextractwith0.11volumesbufferB.
B.Spinat39,400for60minutesinOakridgetubesinTi70rotorat4°C.
C.Dialyzefor~2hoursthen~2.5hoursin>50volumesBufferDlackingPMSFincoldroom.
D.Spin14,000rpmfor30minutesinSS-34rotorinOakridgetubes.
E.AliquotS100into1mlfractionsandfreezeonN2andstoreat-80°C.
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