分选前标本制备

MACS技术可以使用的细胞来源很广泛，包括人类的外周血、骨髓、脐带血、冷冻保存的外周血和骨髓、淋巴结、扁桃腺、肿瘤组织、体腔液，小鼠的脾脏、骨髓、胎肝、胸腺、淋巴结，其他动物以及其他种类的细胞(如培养细胞、大脑细胞、皮肤细胞等)。由于细胞团块和死细胞的存在一方面会堵塞分选柱，降低分选效率，另一方面会与磁珠非特异性结合，造成分选后细胞纯度降低。因此分选前的标本制备是一个很重要的环节。标本制备方法主要包括密度梯度离心、组织消化法(机械分离、生物化学分离）过滤、裂解红细胞。

密度梯度离心

密度梯度离心是最常用的标本制备方法，使用的试剂主要有Ficoll液和Percoll液。

具体方法参见1.1节。

组织消化法(机械分离、生化分离）

组织标本的MACS分选中，一个很重要的问题就是如何成功获得单细胞悬液。操作中可能会用到机械分离和酶分离方法，前者包括切割和钢网研磨，后者包括(如黏附的培养细胞)和酶(胰蛋白酶、胶原酶、解离酶)消化方法。做酶消化时要考虑到是否会损坏用来做磁性标记的细胞表面抗原。如果标本中含有大量死细胞，则需要使用含有DNA酶的缓冲液。具体方法参见1.5节。

以胶原酶D处理小鼠脾细胞为例：

⑴在直径6cm的平皿内加入足以覆盖底部的胶原酶D(大约5ml)，把小鼠脾脏放入平皿中。

(2)使用Iml注射器和25G针头将5004胶原酶D注入小鼠脾脏。

(3)用剪子和镊子将小鼠脾脏剪成小片。

(4)371条件下将小鼠脾脏碎片在5ml胶原酶D中孵育45〜60min。

(5)将剩余的组织和胶原酶D消化的细胞在钢网上研磨过滤。

(6)将所有细胞收集在50ml试管中，计数。加入缓冲液直至终体积为15ml，200g离心lOmin，用生理盐水或PBS洗涤细胞。

(7)小心地去除上清，按照说明书调整体积。

过滤

为了去除组织团块和黏附成团的细胞，得到单细胞悬液，需要进行过滤。一般血细胞大小为7——20Um，因此建议在分选前使用30um(400目左右)滤网对标本进行过滤。

裂解红细胞

(1)在1倍体积的细胞悬液中加入5——1〇倍体积的红细胞裂解缓冲液，室温下孵育5min

(2)20℃、3oog离心IOmin，小心地去除上清。

⑶加入缓冲液洗涤2次，20℃、200g离心lOmin，小心地去除上清。

(4)在适当的缓冲液内重悬细胞，计数并进行磁性标记