单抗贴壁铺展法

单抗贴壁铺展法又称洗淘法(panning)。此方法的基本原理是抗原-抗体的特异性结合反应，因此称为单抗贴壁铺展法。将聚苯乙烯培养瓶或培养板用抗体包被，然后将细胞与其共孵育，这样，那些表达所包被的抗体所对应的抗原的细胞就选择性地结合到培养瓶或培养板的表面而与其他未结合的细胞群分开。收集未黏附细胞群，即阴性选择；漂洗培养瓶或培养板后，收集黏附细胞群，即阳性选择。如利用CD34单克隆抗体(McAb)
孵育骨髓单个核细胞悬液，然后将孵育过的细胞悬液加至已包被好羊抗鼠抗体的培养瓶或培养板中。这样通过抗鼠抗体-CD34——McAb的桥联结合反应使CD34+细胞结合固定在细胞培养板底，而非固定的淋巴细胞(CD341可通过轻吸培养板孔或培养瓶内细胞悬液而获得。此种方法还适用于T细胞与B细胞、T细胞亚群CD4+或CD8+细胞及CD4—CD8-双阴性T细胞等细胞的分离。在此，以骨髓CD34+细胞的分离纯化为例介绍此法。

实验材料、试剂及配制

⑴淋巴细胞分层液：有成品供应，密度为d.〇77±〇.〇〇l)g/ml。

(2)2%台盼蓝染液，见附录2。

(3)6孔平底细胞培养板、毛细吸管等。

⑷抗人CD34单克隆抗体，羊抗鼠抗体。

操作方法

(1)密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(方法见密度梯度离心法)。

⑵制备洗淘板在6孔平底细胞培养板的每个孔中加2.5ml羊抗鼠(IgG和IgM)抗体[每孔加10——20吨抗体，以F(ab〇2羊抗鼠IgG和IgM为准]。然后置室温4〜6h或代过
夜。将上清液吸出，吸加含1%FCS的PBS液2.5ml于每孔，轻轻振摇，吸出所加液体，同上再吸取2次。然后将2.5mlPBS(含1%FCS)加人孔内，室温封闭30min。用前用PBS洗涤2次，末次洗涤后，吸尽孔中液体。

(3)将2xl0⁷个/ml的骨髓单个核细胞悬液置于15ml离心管中，4℃、400g离心lOmin，弃上清，用含适合浓度的CD34抗体悬起细胞，冰浴中孵育30min。

⑷按每孔Iml细胞悬液的量加至已包被羊抗鼠抗体的6孔洗淘板中，然后置代孵育30——45min，轻吸孔内细胞悬液，此悬液即为CD3-细胞。

(5)弃去每孔中的液体，PBS洗涤一遍后，机械剥离黏附在培养皿表面的细胞，即用预冷的PBS/0.2%BSA用力冲洗平皿底部，收集冲下的细胞即为CD34+细胞。

注意事项

(1)上述方法适用于这样的场合：待选择分离的细胞不会自发地黏附于塑料上。

⑵也可用25cm2或28cm2的细胞培养瓶进行抗体包被，每瓶内加2mlF(ab^r)2羊抗鼠抗体(lmg/ml)，在41冰箱内可长期存放。用前可将抗体液移出至另一培养瓶内继续包被。这种抗体液可重复使用1〇〜15次。用PBS洗涤后的已包被好的培养瓶需在2〜3h内立即使用。

(3)有的实验室采用PH9.6的碳酸盐缓冲液作为抗体的包被液，其目的在于其能使抗体牢固地与包被板表面结合。

(4)panning法可用于分离混杂悬液中的大、小细胞群。用多克隆抗体包被效果好，
但用McAb包被分离效果不满意。所以，采用间接panning法为好。
(5)间接panning法不仅可用于分离多种细胞(直接法只能分离抗体相应的细胞)，而且致敏细胞所用McAb无需纯化。间接法可用于同时黏附多种McAb混合致敏细胞，以去除多种细胞。
(6)间接panning法需用大量的高亲和层析纯抗体或高效价、特异性好的抗血清进行纯化。纯化的效果还取决于细胞黏附塑料平皿的强度和抗体结合塑料的能力。