蛋白质检测－WesternBlot

1.把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。

1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。

2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。

3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。

4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。

5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。

6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。

2.将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。

3.用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。

4.膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。

5.室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。

6.用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。

7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。

8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）

9．用总体积300mlPBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。

10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。

11．按步骤9洗涤。

12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动1小时。

13．按步骤9洗涤。

14．配制显色指示剂/底物：混合显色指示剂原液3.0ml，PBS9.0ml，加入1%过氧化氢150.0微升。立即使用。

15．于室温下摇动直至出现紫色并开始看到背景（1~10分钟）。

16．将薄膜转到另一盛水容器中洗涤，终止显色反应，空气干燥，封入塑料袋中避光保存。