酵母免疫荧光

1）细胞制备

1．培养5ml酵母至对数生长早期（10⁶～10⁷细胞/ml）。

2．直接加1/10体积的甲醛到培养基里固定细胞（加入的甲醛终浓度为3.7％，标准母液是37％）。

3．细胞在甲醛中培养至少1小时。

4．离心收集细胞，用0.1mol/L磷酸钾（pH7.5）洗一次。

5．把细胞悬浮在1ml的50mg/ml消解酶100T或50单位/ml的溶细胞酶[溶于含有2ml/ml6-巯基乙醇的0.1mol/L的磷酸钾溶液中]。

6．置30℃培养30分钟，用相差显微镜检查原生质的生成率。细胞应呈黑色或半透明灰色，亮细胞（折射体）属于没有充分被消化的。菌蜕属消化过夜。

7．离心收集细胞，悬浮在1ml的PBS中。

2）染色

1．取10ml的1mg/ml聚赖氨酸，放到用特氟隆封闭的（Teflonmaskedslides）载玻片（10孔载玻片）上的每个孔，再用蒸馏水洗载玻片，干燥。

2．放10ml固化细胞到每个孔中，几分钟后，用PBS抽洗3次。用显微镜检测载玻片确保呈合适的密度而不聚集。

3．该步骤可任选（本实验不需要使用抗体，但建议使用）：把载玻片浸泡在冷甲醇（－20℃）6分钟后，然后放到冷丙酮（－20℃）30秒，该处生理产生扁平细胞，有助于细胞骨架的观察。对于一些抗体-抗原结合物，需要这些步骤重新活化，用PBS重新润湿玻孔。

4．加15ml由PBS＋3％BSA（牛血清白蛋白）组成的阻断缓冲液到玻孔中。在保湿盒子中，如垫有湿纸巾的平板中保温30分钟。重要的是，在这期间不能让载玻片孔干透（BSA可通过阻断蛋白质结合位点降低非特异抗体结合到载玻片）。

5．吸出阻断缓冲液，用PBS＋3％BSA洗两次。

6．加10～15ml第一抗体（溶解在PBS＋3％BSA）到载玻片孔中，在一个保湿盒中保温1小时。用亲和纯化抗体或单克隆抗体，如果可能，用缺乏目的抗原的同源对照。作一个没有第一抗体的对照也是有帮助的。

7．吸出第一抗体，用PBS＋3％BSA洗3次。

8．用荧光第二抗体重复第6～7步（在暗处培养）。

9．吸出第二抗体，用PBS＋3％BSA洗3次。

10．加10～15ml的1μg/mlDAPI到载玻片孔中，培养约1分钟，用PBS洗3次。

11．吸出PBS，给每个孔加一小滴封固剂，放盖玻片，避免在孔中出现气泡。用纸巾除去多余的封固剂，小心不要移动盖玻片，用干净的指甲油密封，－20℃下保存。