1　材料　地塞米松磷酸钠注射液(江苏第三制药厂,批号000706);RPMI-1640培养基(Gibco,USA)(每升含10%小牛血清、L-谷氨酰胺0.33mg、青霉素100u、链霉素100u、pH-7.4);胰蛋白酶(Difco,Lot:12885655);四甲基氮唑盐(MTT)(FLUKA,Switzerland);FLUO-3/AM(CALBIOCHEM,Ca);二甲基亚砜(DMSO)(Merck,USA);SOD与MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所);吖啶橙(AO)、溴乙啶(EB)(FLUKA,Switzerland);酶标仪(Bio-Rad,USA);荧光显微镜(OLYPUS,Japan);激光共聚焦显微镜(BIO-RAD公司MRC-1024型,USA)。SD大鼠(南京中医药大学,动物合格证号:SCXK(苏)2002-0012)。2　骨骼肌细胞原代培养　取出生1d的SD大鼠四肢肌肉,切碎后用37℃的消化液(0.05%胶原酶和0.25%的胰蛋白酶)消化两次,每次15min。经Percoll密度梯度离心后,收集细胞,用Hank′s液洗两次,199细胞培养液(10%胎牛血清)悬浮细胞,接种入细胞培养皿。37℃培养12h后收集未贴壁细胞并计数,种入细胞培养板,37℃培养。待细胞生长并融合进行如下实验。3　细胞增殖测定(MTT比色)　设地塞米松大(5mmol/L)、中(1mmol/L)、小(0.2mmol/L)剂量组,于加药培养后的第24h从96孔培养板中吸取100μl培养上清液,每孔加入25μl浓度为5mg/mlMTT溶液后,继续培养4h,吸去旧培养液,再向各孔加入100μl的二甲基亚砜(DMSO)100μl,振荡5min,等细胞代谢MTT后所形成Formosan充分溶解后,用酶联免疫检测仪测定490nm处的吸收度值。4　SODMDA测定　于加药培养后的第24h从96孔培养板中吸取的100μl培养上清液,按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明进行测定。5　形态学方法　将骨骼肌细胞接种于处理过的载玻片上,以1mmol/L地塞米松作用24h后,分别收集上清细胞及贴壁细胞,加吖啶橙和溴乙锭(AO/E染液,在荧光显微镜下观察活细胞(VN),核染色质着绿色并呈正常结构;早期凋亡细胞(VA),核染色质着绿色呈固缩状或碎裂状;晚期凋亡细胞(NVA),核染色质着橘红色呈固缩状或碎裂状;坏死细胞(NVN),核染色质着橘红色并呈正常结构。并计算损伤率:损伤率=[(VA+NVA+NVN)/总细胞数]×100%。6　钙离子动态变化的测定　用敏感性钙指示剂FLUO-3/AM,结合激光共聚焦显微镜(LaserScanningConfocalMicroscopy,LSCM)检测技术,分析细胞内钙离子的动态变化。储备的FLUO-3/AM用D-Hanks液稀释至5μmol/L,取10μl加于培养的骨骼肌样品上,置5%CO2孵箱中孵育30min。然后用D-Hanks液洗1次,再用激光扫描共聚焦显微镜观察FLUO-3/AM染色的骨骼肌某一层面的萤光图像。取地塞米松10μl轻轻加入孔中,使终浓度达到1mmol/L,迅速以间隔4s的速度扫描,计算机记录储存扫描结果,使用软件为TimeCourse(KineticImagingSoftwareforMRC-1024andMRC-1024UVConfocalImagingSystems)及Lasersharp数据处理软件。

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