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Human Embryonic Stem (ES) Cell Protocols——Splitting Human ES cells on Matrige
basedonsplittingontoonplate
WarmCollagenasemediato37°Cinawaterbath.
Aspiratemediaoffofcellcultureplate.
Addthefollowingamountofcollagenase
0.5ml/wellof4wellplate
1.0ml/wellof6wellplate
Incubateat37°Cfor5-10minutes;stopincubationwhenedgesofcoloniesbegintopullawayfromtheplate.
Aspiratethecollagenaseandaddappropriatevolume(3ml)ofconditionedmedia(CM)totheplate(seenotes).
CollectcellsoffoftheplatebyscrapingandwashingwiththeCM,transfertoa15mltube.
Aspiratematrigeloffof6wellplate(seematrigelaliquotingandplatingprocedure)
Add2mlofCMperwellof6wellplate.
Add5ulbFGF.
Plate0.4ml/wellintoeachwelluntilthereisapproximately0.6mlremaining.
Addtheremaining0.6mldropwisetoeachwelluntildone.
Makesurethecellsareevenlydistributedacrosstheplate.
Placegentlyintoincubator.
Letsettleovernight.
Notes:
HighdensityMEFsforCMlastabout2weeksafterplating.Besuretocheckthemregularlyforcelldeath.
bFGFisstableat4°Cforonemonth.
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