Protocol

1.准备ES细胞到matrigelplate，去除MEFs

►准备1:3matrigelplate：冰上预冷TC培养板和移液管，冰箱或者冰上解冻1:3matrigel。小心把matrigel包被在板子上且保证覆盖底部，然后吸出多余的matrigel（在包被matrigel过程中保持所有东西预冷）。把matrigelplates放在冰上30min。再次吸出多余的matrigel并把包被matrigel的板子37◦C孵育30min。

►37◦CTrypLE处理融合的ES细胞2-3min（10cmdish用4mlTrypLE或者6孔板的每孔1ml），然后吸出TrypLE。用washmedia(IMDM+Glu+P/S+0.1%BSA)洗2-3次。10cmdish加4mlhESmedia或者6孔板的每孔1ml，用细胞刮棒刮去板子底部的ES细胞。上下吹打3-5次，显微镜下观察直到可以得到5-10个细胞团。

►接种细胞到matrigel-coated板子上

2.设置T0：5%O2,5%CO2条件下，当有70-80%融合时，细胞会发生分化。用washmedia洗细胞2次并添加适量体积T0培养基（如10cmdish加10ml，6孔板的每孔2ml）

3.用washmedia洗细胞并且每天更换培养基直到T5。前几天看到大细胞死亡是正常现象。

4.进入肝分化，用Accutase37◦C3min分离T5细胞，washmedia洗细胞两次。6孔板的每孔加入1mlwashmedia并刮下细胞。收集T5细胞，1200rpm离心3min。用T5media重悬细胞并且以1:6接种细胞到matrigel-coated6孔板，250Kcells/well。

5.每2天用不同分化培养基接种细胞（如下），并在18-25天收集用于分析。

注：matrigel的每批内毒素水平和蛋白浓度都有差异，建议内毒素水平不高于2units/mL，蛋白水平应在7-10mg/mL之间。如果蛋白水平较高，可能要多于1:1稀释，这取决于hESC克隆形态和hESC分化为需要系别的能力。操作matrigel过程中，所有管子、培养板和移液器都必须是预冷的，matrigel室温下回凝固。

附：

1)hESMedia(500ml)

DMEM/F12:400ml

KOSR:100ml

NEAA:5ml

L-glutamine:5ml

Pen/strep:5ml

β-Mercaptoethanol:3.5ul

bFGF:10ng/ml(50ulof100ug/ml贮存)

L-AscorbicAcid:50ug/ml–每次培养基更换加新鲜的5mg/ml贮存液

2)分化培养基：

(3)肝分化培养基:

以上内容摘自StemBook-protocols

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