2021-07-25免疫标记技术（酶联免疫吸附试验,酶免疫组化技术,酶标免疫定量测定,免疫荧光技术,斑点金免疫渗滤试验）

【文章介绍】

实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。BioRike博瑞克根据《医学免疫学实验指导》一书系统整理了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。

BioRike简介：BioRike（中文简称“博瑞克”）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌,由旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室，专门从事以ELISA试剂盒、抗体、细胞因子、免疫检测试剂盒、血清等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。

一、酶联免疫吸附试验（ELISA）

酶联免疫吸附试验（ELISA）是将抗体（抗原）包被在固相表面后，按不同的步骤加入待测抗原（抗体）和酶标抗体（抗原），充分反应后用洗涤的方法，使固相上形成的抗原抗体复合物与其他物质分离，洗去游离的酶标抗体（抗原），最后加入底物，根据酶对底物催化的显色反应程度，而对标本中的抗原（抗体）进行定性或定量。

ELISA的技术类型有多种，常用的有间接法、夹心法和竞争法等，本次实验介绍间接法。

【实验目的】

掌握酶联免疫吸附试验的基本原理和临床意义，了解其实验操作技术。

【实验原理】

将抗原结合到固相载体上，当加入阳性标本后，相应抗体将结合到固相抗原上，利用酶标记的抗抗体可检测出标本中与固相抗原结合的抗体。

【实验材料与仪器】

抗原与抗体：伤寒O诊断菌液；待测血清；阳性对照血清；阴性对照血清；酶标抗人IgG抗体。

试剂：包被稀释液；样本稀释液；辣根过氧化物酶底物液（TMB-过氧化氢尿素液）；终止液。

仪器：酶标板；吸水纸；移液器等。

【实验方法及内容】

1.包被抗原：将抗原用包被稀释液做1：20稀释，每孔加入100μl，置37℃作用4h或4℃作用24h。

2.洗涤：弃去孔中液体，用洗涤液洗3次，每次1min。于吸水纸上拍干，4℃储存备用。

3.加入待测样本：用样本稀释液对待测标本进行适当稀释，将稀释好的标本加入酶标板反应孔中，每孔100μl，置于37℃作用30min。注意应做阴性对照和阳性对照。并作复孔检测。弃去孔中液体，用洗涤液洗3次，每次1min。于吸水纸上充分拍干。

4.加入酶结合物用样本稀释液对酶结合物进行适当稀释（根据酶结合物说明书提供的参考工作稀释度进行预试确定稀释倍数），将稀释好的酶结合物加入反应孔中，每孔100μl，置于37℃作用30min。洗涤同第2步。

5.加入底物显色每孔加辣根过氧化物酶底物液100μl，置37℃蔽光显色10～20min。

6.终止反应当阳性对照出现明显颜色变化或阴性对照稍有颜色变化时，每孔加入终止液50μl终止反应，于20分钟内测定实验结果。

【实验结果与判定】

1.肉眼判定：明显显色者为阳性，不显色者为阴性。

2.酶标仪判定：采用反应底物的最大吸收波长测定OD值，本实验底物为TMB，最大吸收波长为450nm，因此应测定OD450值。

【注意事项】

1.加样本稀释液必须使用微量移液器；加入样本后必须混合均匀。

2.严格控制反应时间，洗板时严格按操作规程进行，每一操作间隔不超过10min。

【思考题】

ELISA法用于检测抗原和检测抗体的类型各有哪些？各种方法有何特点？其临床应用如何？

二、酶免疫组化技术(Enzymeimmunohistochemistrytechnique)

酶联免疫组化技术是直接以细胞或组织切片为抗原相，以酶联免疫技术检测抗原或抗体的存在与否或定位的一类酶标技术。该方法。本实验以酶免疫组化技术检测CD3为例。

【实验原理】

将组织或细胞制成切片或涂片，用酶标记的抗体检测组织细胞表面分子。本实验以CD3单克隆抗体与待检单个核细胞涂片作用，再用生物素化抗鼠IgG检测CD3单抗与待检细胞结合的情况，最后用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶放大系统(ABC桥联法)，CD3表面分子阳性细胞将被抗体与过氧化物酶结合物结合，在底物作用下将被染成棕黄色，CD3表面分子阴性的细胞不着色。根据细胞着色的情况可以判定CD3阴性和阳性的细胞，通过细胞计数测定其阳性百分率。

【主要试剂与器材】

1.正常山羊血清。

2.抗CD3单克隆抗体。

3.生物素化羊抗鼠IgG(二抗)。

4.链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(SABC)。

5.3,3，-二氨基联苯胶(DAB)。

6.0.0lmol/LpH7.2PBS。

7.淋巴细胞分离液。

8.丙酮。

9.玻片、吸水纸、显微镜等。

【操作方法】

1.采集外周血，以肝素抗凝。抗凝外周血经淋巴细胞分离液梯度离心，分离单个核细胞。

2.将单个核细胞制成涂片，室温风扇吹干。

3.以纯丙酮室温固定20min(干燥后可冰冻保存)。

4.滴加抗CD3单克隆抗体，37℃温育45min。

5.将生物素化羊抗鼠IgG滴加在玻片上，置湿盒中37℃温育30min，以PBS洗3次，每次3min，然后用吸水纸将细胞周围处擦干。

6.滴加试剂SABC，置湿盒中37℃温育30min。

7.加DAB显色，室温显色5～20min，用蒸馏水洗涤，加盖玻片后镜检。

【结果判断】

阳性细胞着棕黄色，在显微镜下观察，计数200个细胞，计算阳性细胞的百分率。

【注意事项】

1.洗涤应严格按要求进行。

2.各步骤尤其加入SABC后，反应时间应严格控制，否则易出现非特异性显色，产生假阳性反应。

3.观察阳性细胞需要一定的经验，需要反复练习，才能准确掌握。

【应用与评价】

CD3分子的主要功能是转导TCR特异性识别抗原所产生的活化信号，促进T细胞活化。CD3分子分布于所有成熟T淋巴细胞的的表面，是成熟T淋巴细胞的标志。本实验测定计数CD3分子阳性细胞数量有助于计数成熟T淋巴细胞的数量，反映机体细胞免疫水平。细胞免疫缺陷、细胞免疫功能不全或低下者CD3分子阳性细胞数量下降。

本法简便易行，敏感性高，使用光学显微镜即可观察结果，无需特殊仪器，一般实验室均可开展。

【思考题】

1.影响酶免疫组化方法的因素有哪些？如何保证实验的稳定性?

2.酶免疫组化方法有哪些类型?各有什么特点?

三、酶标免疫定量测定

酶联免疫吸附试验（ELISA）中待测标本的含量与底物显色呈比例关系，因此从同时与临床标本同样测定的标准抗原物质的浓度系列得到的剂量反应曲线即可得到待测抗原的浓度。本次实验学习ELISA双抗体夹心法定性检测人血清中甲胎蛋白（AFP）。

【实验原理】

将酶与抗体（或抗原）用交联剂结合起来，此种酶结合物能与相应的抗原（或抗体）发生特异性结合反应，形成酶-抗原抗体大分子复合物，此时再加入酶底物，底物被酶催化生成有色产物，最后借助反应体系的颜色变化及呈色深浅来推断样品中检测对象的有无或含量。

【试剂与器材】

1.待检患者血清。

2.抗甲胎蛋白抗体。

3.甲胎蛋白阳性和阴性血清。

4.辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗甲胎蛋白抗体。

5.碳酸盐缓冲液（PH9.6）。

6.磷酸盐缓冲液（PBS，PH7.4。）

7.邻笨二胺液。

8.硫酸（2M）。

9.酶标反应板、微量加样器、温箱、冰箱、酶标仪等。

10.包被稀释液（0.05mol/LNa2CO3—NaHCO3缓冲液，PH9.6）：Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，加双蒸水至1000ml。

11.封闭液（5%小牛血清/PBS溶液）：小牛血清50ml，PBS（PH7.4）950ml。

12.洗涤液（PBST，PH7.4）：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4•12H2O2.9g，KCl0.2g，Tween200.5ml，加双蒸水至1000ml。

13.样本稀释液（PBS，PH7.4）NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4•12H2O2.9g，KCl0.2g，加双蒸水至1000ml。

14.酶标第二抗体：羊抗人IgG标记HRP（1：2000）。

15.底物液（OPD—H2O2）。

16.A液（0.1mol/L柠檬酸溶液）：柠檬酸19.2g加双蒸水至1000ml。

17.B液（0.2mol/LNa2HPO4溶液）：Na2HPO4•12H2O71.7g，加双蒸水1000ml，临用前取A液24.3ml，B液25.7ml。

18.终止液（2mol/LH2SO4溶液）：双蒸水600ml，浓硫酸100ml（缓慢滴加并不断搅拌），加双蒸水至900ml。

【操作方法】

（1）包被酶标反应板：用pH9.6的碳酸盐缓冲液1：200稀释抗体，用之包被聚乙烯塑料板，每孔加0.2ml，4℃12~24h。

（2）封闭酶标反应板：弃掉包被液，用PBS洗涤3次，甩干后用5%小牛血清/PBS液封闭。放37℃40min（或4℃过夜）。封闭结束后用洗涤液洗板，并在滤纸上拍干，每孔洗3遍，每遍3min。

（3）加入待测样品及阳性对照（用PBS稀释）：将稀释好的待测血清样品加入酶标反应板中，每孔0.2ml，阳性对照样品亦相应稀释。置于37℃温箱0.5~1h。弃去孔中液体，用洗涤液洗涤3遍，每遍3min。

（4）加酶标二抗（用PBS稀释）：加入辣根过氧化物酶标记的抗甲胎蛋抗体，每孔0.2ml置于37℃温箱，30~45min。弃去孔中液体，拍干，每孔洗涤3遍，每遍3min。

（5）加入底物液：取底物液A液24.3ml，B液25.7ml，加双蒸水50ml得pH5.0的磷酸-枸缘酸缓冲液100ml。再加入邻苯二胺40mg，充分溶解，最后加入30%H2O20.15ml。每孔加入底物液100μl。避光室温作用5~10min。

（6）终止反应：当阳性对照出现明显颜色变化后，每孔加入终止液50μl终止反应。

【结果分析】

1.目测：根据显色深浅，用（-）为无色，（+）为浅色，（++）为黄色，（+++）为棕黄色表示。一般呈++以上者为阳性。

2.酶标仪测定：在492nm波长下测OD值。

【注意事项】

1.封闭时注意将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中可能产生的贴孔壁气泡。

2.加洗涤液时，每孔加满，但不要溢出。

3.每次洗涤液在孔中的停留时间不应少于1分钟。

4.洗涤后板要甩干，不要残留液体。

四、免疫荧光技术

荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。

【实验原理】

以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。

【试剂与器材】

1.抗原片：现多用商品试剂。如需自行制备，方法如下：

(1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞。冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。

(2)Hep-2细胞抗原片制备：Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培养基。干燥后，用无水乙醇固定。

(3)肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl。-30℃保存备用。

2.异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG抗体(FITC-抗人IgG抗体)有商品供应，临用时按效价稀释。

3.0.01mol/LpH7.2PBS

4.缓冲甘油取甘油9份加PBS1份。

5.待测血清、阳性和阴性对照血清临床标本筛选获得。

6.器材荧光显微镜、孵箱、有盖湿盒、染色缸、吸管、试管等。

【操作方法】

1.准备：检查加样板，生物载片恢复室温，标记。

2.稀释：PBS-Tween缓冲液稀释血清，设阴阳性对照。

3.加样：加样板放于泡沫塑料板上，加25μl稀释后血清，至加样板的每一反应区，避免气泡。加完所有标本后开始温育。

4.温育：将生物薄片盖于加样板的凹槽里，反应开始，室温温育30分钟。

5.冲洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween缓冲液的小杯中至少1分钟。不必混摇。

6.加样：滴加20μl荧光素标记的抗人球蛋白（结合物）至一洁净加样板的反应区，完全加完方可继续温育。荧光素标记的抗人球蛋白用前需混匀并以PBS-Tween缓冲液稀释。

7.冲洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween缓冲液的小杯中至少1分钟。不必混摇。

8.封片：将盖片直接放于泡沫塑料板凹槽中，滴加甘油/PBS至盖片：每反应区约10μl。从PBS-Tween缓冲液中取出1张生物薄片，用纸擦干背面和四边。还要擦拭反应区间隙。将生物薄片面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并调整使盖片嵌入载片的凹槽中。然后继续下1张。

【结果判定】

1.细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。

2.根据细胞核着染色荧光的图像，可区分为：

①均质型：细胞核呈均匀一致的荧光；

②周边型(核膜型)：细胞核周围呈现荧光；

③斑点型(颗粒型)：细胞核内呈现斑点状荧光；

④核仁型：核仁部分呈现荧光。

⑤混合型：两种以上核染色；

⑥应用细胞片做抗原片可检出着点型(ACA)

【注意事项】

1.PBS-Tween缓冲液在4℃下可存放两周。

2.根据每次实验的标本量决定需要稀释的FITC标记的抗人球蛋白的量，稀释后可在4℃下可存放1周。

3.血清或FITC标记的抗人Ig应滴加至加样板上，不能直接滴到载片上。

4.载片盖到加样板上后，确保反应区与液滴完全接触后，才开始记时温育。

5.冲洗载片时水流要缓慢，以免冲洗掉基质。载片上的反应区应保持湿润，不要将载片风干。

6.封片进不可用力挤压盖玻片，以免损坏基质。可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。

7.封片介质含有荧光稳定剂，应保存在2-8℃。封好的载片可于4℃长期保存。

【实验讨论】

方法评价：间接免疫荧光技术是检测ANA最常用的方法。该方法简便、敏感，且可根据核染色形态确定核抗原的类型。

鼠肝印片细胞分布不均匀，多有重叠，冲洗时易丢失。Hep-2细胞具有核大、有丝分裂旺盛、核内细胞器较明显、具备人源性抗原的特征，对诊断和鉴别不同类型的自身免疫病十分有利。

五、斑点金免疫渗滤试验

斑点金免疫渗滤试验（dotimmunogoldfiltrationassayDIGFA）又称滴金免疫测定法，简称“滴金法”。因其最大的特点是简便、快速，故称为快速斑点免疫结合试验。本次实验以双抗体夹心法测定尿中HCG为例进行实习。

【实验原理】

选取二株抗HCG不同决定簇的抗体其中一株抗HCG抗体用胶体金标记，制备成抗HCG免疫复合物；另一株抗HCG抗体吸附ＮＣ膜表面形成斑点。当滴加在膜上的标本液体渗滤过NC膜时，标本中所含HCG被膜上抗HCG抗体捕获，其余无关蛋白等滤出NC膜片。其后加入的抗HCG免疫金复合物也在渗滤中与已结合在膜上的HCG相结合。因胶体金本身呈红色阳性反映即在膜中央显示红色斑点，斑点颜色的深浅与标本中HCG量呈正相关。

【试剂与器材】

1.标本：孕妇尿。

2.试剂盒：包括抗原参照标准液（HCG５０mU╱ml）、抗HCG免疫金复合物、洗涤液（0.02mol╱LPH7.2PBS）、滴金法反应板（由塑料小盒、吸水垫料和吸附抗HCG抗体的ＮＣ膜组成），有商品供应。

3.器材：试管、微量移液器等。

【操作方法】

1.取滴金法反应板平放于实验台上，于小孔内分别标明“Ｔ”和“Ｒ”。

2.在“Ｒ”孔内滴加抗原参照标准液６滴在“Ｔ”孔内滴加尿液标本６滴，待完全渗入。

3.每孔滴加抗HCG免疫金复合物液３滴与NC膜上待完全渗入。

4.每孔加洗涤液３滴待完全渗入。

5.目测观察结果。

【结果判断】

1.抗原参照标准液孔膜上应有清晰的淡红色斑点出现。

2.若标本滴加孔膜上无红色斑点，或斑点显色浅于参照标准液孔，说明标本中HCG含量低于５０mU╱ml；如标本孔斑点深于参照孔，则标本中含HCG含量大于５０mU╱ml。

3.若测定标本为强阳性时，可用洗涤液稀释，按同样的方法测定，稀释至标本斑点与参照孔颜色相当，即可知标本HCG含量（５０mU╱ml×稀释倍数）。

六、斑点免疫层析试验

斑点免疫层析试验（dotimmunochromatographicassay,DICA）又称免疫层析试验，简称“一步金法”。试验所用试剂全部为干试剂，多个试剂被结合在一起约6mm×70mm的塑料板条上，试纸条两端附有吸水材料，成为单一试剂条，本次实验以双抗体夹心法测定尿HCG为例进行实习。

【实验原理】

抗HCG免疫金复合物干片粘贴在近下端，抗HCG单克隆抗体和抗小鼠IgG抗体分别固化于NC膜的测试区和质控参照区。当试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体液体向上端移动，流经干片时，使免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。若标本中有HCG，可与抗HCG免疫金复合物结合。此抗原抗体复合物流至测试区时即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条。

【试剂与仪器】

1.标本：孕妇尿。

2.“一步金法”早早孕妊娠诊断试剂条片，有商品供应。

3.尿液收集杯等。

【操作方法】

将试剂条下端标志部插入尿液中10s左右，取出后放平，置室温下下３min，目测观察结果。

【结果判断】

若出现两条紫红色线为HCG阳性（妊娠），若只出现质控参照线显示紫红色为阴性（未妊娠）。

【实验讨论】

强阳性尿液中HCG含量较多，因此质控线可能不出现或极浅淡，而仅在反应区显示淡紫色条带。应避免试纸条一端插入尿液过深或过浅，插入时间过长或过短也会影响试验结果。

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