实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

1.乙醇沉淀50ug总RNA，重溶于15.5ul无RNase的水中。加入1.5ul10umol/LCDNA引物CP29V，65°C变性5min（如在一个加热块上），冰上冷却。

2.在冰上混合第一链合成反应的成分（总体积29.1ul）：

17.0ul刚刚变性的cDNA和cDNA引物

3.0ul100mmol/L无RNase的DTT

6.0ul5×SuperScript缓冲液

1.5ul10mmol/L无RNase的dNTP

0.6ul40U/ul的RNase抑制剂（如RNasin）

1.0ul200U/ulSuperScriptII逆转录酶

混匀，42°C温育1h。置于冰上中止反应。

3.在冰上混合第二链合成反应的成分（总体积207.2ul）：

48ul5×第二链缓冲液II

3.6ul10mmol/LdNTP

148.4ulH₂O

1.2ul1.5U/ulRNaseH

6.0ul10U/ulE.coliDNA聚合酶I

4.把第一链的和第二链反应体系合在一起。混匀，22°C温育2h。完成第二链合成后，75°C加热20min灭活DNA聚合酶I。

5.用100ulpH8.0的TE缓冲液平衡的酚抽提。再用100ul氯仿抽提。

6.为进行按分子大小选择性的PEG沉淀，小心混合：

200ul酚/氯仿抽提的dscDNA

1.0ul20mg/ml糖原

200ul28％（m/V）PEG8000/3.6mmol/LMgCl₂

反应体系（总体积401ul）室温放置5min，然后10°C，最高速离心15min。70％的乙醇小心洗涤沉淀。

这步沉淀可除去未掺入的cDNA引物和小分子核酸（如低于100nt）。因为PEG大小选择性沉淀易受微小浓度变化的影响，所以必须遵循如下方针：

6.1确保准确吸取200uldscDNA。溶解在水相中的氯仿的蒸气压力倾向于取代吸头中液体的体积使得准确的吸取变的困难。克服这个问题的一个办法是在吸取200ul体积前，先用50～100ul的体积反复吹吸（5～10次）氯仿饱和的水相，使吸头中的氯仿蒸气达到饱和。

6.2因为28％的PEG8000/3.6mmol/LMgCl₂相当黏稠，要小心地慢慢吸取，同样需要确保准确转移所需的体积。

6.3首先小心地重复颠倒混勻，然后剧烈地涡旋混匀。因为溶液黏稠，彻底混匀需要一些时间。

7.在冰上把沉淀溶解在下述溶液里（总共96ul）：

15.0ul10×通用缓冲液

81.0ulH₂O

8.加入4ul4U/ul的MboI，37°C温育1h。65°C加热20min使酶灭活。

9.用50ulpH8.0TE平衡的酚抽提，再用50ul氯仿抽提。加入1ul糖原和10ulpH5.2的3mol/L乙酸钠，2.5倍体积100％的乙醇。最高速离心20min，70％乙醇洗涤沉淀。轻微晾干（5～10min）。不要加热或真空干燥，因为过度的干燥会使得DNA沉淀很难溶解。

10.把沉淀溶解在由以下成分组成的连接混合液里（总体积20ul）

1.2ul10×连接缓冲液

2.0ul10mmol/LATP

8.0ul0.5ug/ulMboI-连接子ML2025

7.8ulH₂O

1.0ul1U/ul的T4DNA连接酶

16°C连接过夜或4°C连接一个周末。

11.加入90ul的水，混匀，用50ulTE平衡的酚抽提，再用50ul氯仿抽提。配制第二次PEG沉淀反应去除未连接的连接子（总体积201ul）：

100ul酚抽提过的连接产物

1.0ul糖原

100ul28％的PEG8000/3.6mmol/LMgCl₂

室温放置5min，然后10°C，最高速离心15min。70％的乙醇小心洗涤沉淀，重溶于40ulpH8.0TE缓冲液。

12.配制第一轮扩增反应。在冰上把3个4umol/LCP28X₁（X₁＝A、C或G）引物和4个4umol/L引物ML19Y₁（Y₁＝A、C、G或T）各1ul两两混合在分开的管里（共12个反应）。用所有其他的成分配制一个通用混合液（一个反应的配方）：

2.0ul模板（PEG沉淀的连接产物）

2.0ul10×PCR缓冲液

1.5ul20mmol/LMgCl₂

0.4ul10mmol/LdNTP

2.0ulRediLoad

9.9ulH₂O

0.2ul5U/ulTaqDNA聚合酶

配制好反应后把管子放到热循环仪上预热到90°C。

13.运行下面的循环程序：

起始步骤：

1min94°C（变性）

25轮循环：

20s94°C（变性）

30s65°C（引物复性）

4min72°C（引物延伸）

最后步骤：

不确定10°C（保持/延伸）

14.每个反应取10ul上样到1.5％的琼脂糖凝胶上，电泳检查是否扩增成功。100bp的序列阶梯作为分子质量对照。

引物量决定产物的量，可以以此调整PCR的条件。长时间的延伸确保不同大小的产物都能得到扩增而没有不利于长片段的偏差。琼脂糖电泳应该出现约100～700bp的拖尾，少有明确的条带（如果有的话）。最重要的是用相同引物扩增的不同RNA样品的扩增产物应该看起来基本一样。

如果出现不同或量不一样，说明扩增前某一步的酶操作效率可能是太低了。

15.用pH8.00.25×的TE缓冲液按1：100稀释反应产物。

16.配制第二轮扩增反应。在两块96孔板上两两混合12个CP28X₁X₂引物和16个MLDY₁Y₂引物（每个样品192个不同的反应；每个20ul）：

2.0ul模板（稀释的第一轮扩增产物）

2.0ul10×PCR缓冲液

1.5ul20mmol/LMgCl₂

0.4ul10mmol/L标准dNTP

2.0ul4umol/L引物CP28X₁X₂（X₂＝A、C、G或T）

2.0ul4pmol/L标记的引物’MLlSY₁Y₂（Y₂＝A、C、G或T）

2.0ulRediLoad

7.9ulH₂O

0.2ul5U/ulTagDNA聚合酶

确保每个反应，第一轮和第二轮使用的一致的X₁和Y₁。

17.运行步骤13的程序，但只要20个循环。用琼脂糖凝胶电泳检查是否扩增成功（也见步骤13）。

18.每个反应转移5ul到新装有5ul甲酰胺缓冲液的96孔板上。75°C变性2min。

19a.放射性标记样品：取1～2ul上样于6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

19b.非放射性标记使用直接印迹电泳。