2012-12-26【求助】求助BD elispot

请问有战友也在用BD公司的ELISPOTset试剂盒吗？有些问题想要请教一下大侠们。我按照操作说明的步骤（PBS、PBST、去离子水均过滤）做了2次elispot，无论阳性刺激（我用的PHA刺激的新鲜分离的人PBMC，终浓度为10ul/ml，PHA用于流式时是以刺激细胞产生细胞因子的）孔、阴性孔均没有真正的斑点，而且背景看上去不细致，颜色不均匀（不是大片缺失，看上去有点像用蜡笔涂出来的样子），有没有谁也遇到过这种情况，可能的原因是什么呢。用于封闭和培养细胞的完全培养基（1640+10%FBS+1%双抗）配好后需要过滤吗（我尝试过过滤，可是培养基挺粘，不好虑就放弃了）？我的FBS之前放的-20度，用之前放4度化开的，肉眼没看到任何沉淀产生。还有用于稀释二抗和HRP的10%FBS.PBS配好以后还需要过滤吗（PBS是过滤过的）？之前用看Daclone公司的试剂盒实验步骤需要用70%乙醇预湿PVDF膜，但是BD公司的没有这一步，直接加captureantibody工作液，4度过夜，不知道预湿这一步对背景有没有影响，有做BDelispot时也加上预湿这一步的吗？想到的大概都是这些，语言有些混乱，这一关过不了，后面的实验就无法开展，急得很啊！！急切盼望高手指导！打算明天重新配细胞培养基、PHA按照操作手册再做一次，希望能有好的结果。