酶联免疫斑点实验(enzymelinkedimmunospotassay,ELISpot)是一种在96孔板内的一百万个细胞中实现对单个分泌细胞进行定量检测的新型的免疫酶技术。灵敏度高，易操作，成本相对流式细胞术较低，已被广泛应用于癌症研究，疾病探索以及疫苗研发等领域。

ELISpot原理：将细胞置于包被有特异性抗体的96孔板中培养，在有刺激的条件下，细胞分泌的细胞因子或免疫球蛋白会被包被抗体捕获。移除细胞后，被捕获的细胞因子可进一步使用生物素标记的二抗来标识，其后再与酶标记的亲和素作用，并加入底物使其呈色，有反应作用的细胞会留下直径大小不等的染色斑点。

1.加入细胞到含有（或不含）刺激物中培养；

2.阳性细胞开始分泌细胞因子，细胞因子就近被包被抗体捕获；

3.移出细胞，清洗板子，加入生物素标记的检测抗体，形成“抗体-抗原-抗体”夹心结构；

4.为了观察膜上斑点的形成，加入酶标记的亲和素；

5.加入显色底物，在酶的催化分解下，生成不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点；

6.斑点计数（可人工计数，也可用自动读板仪计数），数据处理，结果分析。

常见疑难问题解答：

1.您推荐哪种ELISpot板子？

我们建议使用PVDF膜的96孔ELISpot板子，有效结合大量捕获抗体，前提是膜用乙醇预处理（即活化）。

2.板的颜色是否重要，我应选择白色板子还是透明板子？

白色和透明ELISpot板具有相同类型的PVDF膜。这两种颜色在读板仪中略有不同，但并不重要。（如果有没有添加液体的漏掉的孔，透明的板子很容易看见。）

3.包被前为什么要用乙醇对ELISpot板进行预处理？

ELISpot板子的膜具有多孔疏水结构。为了使大量捕获抗体能够结合，应该用乙醇处理膜以使其亲水。这是获得高质量斑点所必需的致密抗体包被层。

4.如何清洗和清空ELISpot板？

可以使用多通道移液器手动清洗板子。在不需要无菌条件的洗涤步骤中，可以使用常规ELISA板洗涤器，条件是洗涤头适合于ELISpot板。将盘子倒置在废物容器上，将盘子倒空。当手动清空板子时，确保液体不会从废物容器中“溅出”。当盘子已经清空时，可以将其倒置在干净的纸巾上，以从孔中除去残留的液体。对于底物反应后的最终洗涤，可以用自来水冲洗BCIP/NBT-Plus，去离子水或蒸馏水冲洗TMB。

5.什么是预涂ELISpot板？

用于ELISpot和FluoroSpot的预包被板子可随时使用，因为它们在无菌条件下和全自动程序下涂有最佳浓度的捕获抗体。预包被板提供了方便的选择，因为它不需要乙醇预处理和抗体包被过程。还可以最大限度地减少由于手动包被程序的变化而可能出现的变化。

6.包被抗体溶液可以在ELISpot板中保存多长时间？

如果使用无菌板子并且防止蒸发（例如通过将板子包裹在封口膜中），则可以在冰箱中将包被抗体溶液的板子长达一周。重要的是孔不干燥。以这种方式存储的板的功能应由用户评估。

7.冷冻细胞可以用于ELISpot吗？

冷冻保存的细胞非常适合ELISpot。然而，其结果取决于细胞的质量，必须建立冷冻/解冻的程序以产生具有高活力的细胞。标准冷冻程序应包括使用DMSO和胎牛血清或类似物，并逐步冷冻程序。

8.在ELISpot中每孔使用多少个细胞？

必须将每个孔中的细胞数量调整为细胞类型和分泌细胞的预期频率。如果频率非常低，例如10,000个细胞中的1个，则需要更多数量的细胞，通常约250,000个细胞/孔。当分泌细胞的频率高时，例如10个细胞中的1个，约5,000个细胞/孔就足够了。细胞数量在测定中并不总是显示线性，因为需要细胞-细胞的最佳接触，例如抗原呈递细胞的充分刺激。当分析抗原特异性T细胞时，PBMC不应低于每孔200,000个细胞。

我们通常不建议使用超过500,000个细胞/孔，因为这可能产生多个细胞层，反过来由于细胞和ELISpot膜之间的距离增加而导致斑点质量降低。

9.可以在ELISpot中使用人血清吗？

由于以下原因，我们不建议在ELISpot中使用人血清。当分析人类样品时，感兴趣的分析物（例如IFN-γ或IgG）实际上可能存在于血清中。由于分析物将与捕获和检测抗体结合，因此会导致膜变暗。人血清可能含有嗜异性抗体，其可与来自许多物种的Ig交叉反应。这种反应可能会导致双抗夹心免疫检测中抗体交联的问题。在ELISpot中，它将导致膜的普遍变暗。

10.为什么TMB斑点在运行测试后一天内会变黄或几乎消失？

在极少数情况下，当使用自来水进行最后的洗板时，通常不同的蓝色TMB斑点可能会变成难以看见的黄色。这是由水中高含量的离子化合物引起的。如果不确定水质，我们建议用去离子水或蒸馏水冲洗板以停止底物反应。ALP酶和BCIP/NBT-plus底物没有类似的问题。

11.我看到对照孔中没有细胞和刺激的小的非特异性斑点，为什么？

非特异性斑点很少见，但可能会发生。一个原因是生物素化抗体中的聚集物可以在储存后发生。其他原因包括试剂或缓冲液中的污染物或灰尘。为了减少非特异性背景，建议过滤（0.2μm）检测mAb的工作稀释液。

12.在ELISpot孔内部的细胞分布不均匀，为什么？

如果在刺激物之前添加细胞，可能会变得这样。我们不建议将刺激物和细胞混合在一起，然后一次性添加该溶液（细胞+刺激物）。

正确的方法是先加刺激物（悬空滴加），然后悬在孔的正上方，逐滴滴加细胞悬液(自然滴下)，此过程中要避免产生气泡以及剧烈晃动培养板。这样细胞就能依靠扩散的原理，均匀的分布在孔板内，避免了贴壁细胞产生。

注意：一定不要拍击板子来让细胞混匀，那样会适得其反。

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