ELISPOT（Enzyme－linkedImmunospotAssay）全名为酶联免疫斑点检测，结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，能够检测到单个细胞分泌的细胞因子情况。简单来说，就是用包被好的抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其呈现出来。

ELISPOT实验原理

ELISPOT实验使用PVDF膜为底的96孔板（cat：MSIPS4510，Millipore），包被上特异性的单克隆抗体（需要无毒，不含内毒素，亲和力高的抗体），以捕获细胞分泌的细胞因子。

然后在培养板的孔内加入待检测的细胞和抗原刺激物进行培养。在刺激物的刺激下，T细胞就会在对应的时间段分泌对应的细胞因子。此时细胞因子就被包被在膜上的抗体所捕获。

洗去细胞后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点（当然，也可以使用荧光素标记的第二抗体，这样就省去了后续的化学显色方法，并且一次可以检测多种细胞因子），每一个斑点就对应了当初一个分泌细胞因子的细胞。

统计膜上的斑点的数目，再除以当初加入孔内的细胞总数，就可以计算出阳性细胞的百分比。

该技术有以下三大优点：

一：灵敏度高。一百万个细胞中只要有一个细胞分泌细胞因子就可被检测出来，相对于传统的ELISA方法提升了２～３个数量级。

二：单细胞水平，活细胞功能检测。ELISPOT是用抗原直接刺激活细胞，检测的是活细胞的功能。

三：操作简便经济，可进行高通量筛选。ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法。

以上只是ELISPOT的原理，下面直接上干货：标准protocol。

综合了natureprotocol（GuidelinesfortheautomatedevaluationofElispotassays），CTL，mabtech和其他若干paper的经验，写下了这篇标准protocol，一步步走向成功。

以检测IFN－γ为例，本人已经做了20多次，屡试不爽，先show几张图吧：

ELISPOT实验步骤

准备实验，建立好plate布局，至少用3个复孔来测试每一个条件，用4～6个复孔来优化阴性对照。

第1天

A.准备ELISPOTplate（需要无菌条件）１。使用无菌的pH7.4的无钙镁离子的1×PBS（即DPBS）（0.22μm滤器过滤）稀释包被抗体（cat：3420－２H，Mabtech）（１－D１K：１mg／ml）至１５μg／ml（1.5μg／100μl）。

２.取出Millipore96－wellPVDFELISPOTplate（cat：MSIPS4510，Millipore），每孔加入15μl35％乙醇处理2min。

３.无菌水（0.22μm滤器过滤）清洗plate5遍，每次每孔加入200μl。

４.最后一遍弃掉液体后，轻轻在无菌纸上扣干（注意：一定要轻，以防损伤PVDF膜）。

５.每孔加入100μl步骤１稀释的１－D１K抗体溶液，４～８℃孵育过夜。

第2天

B。在plate中培养细胞（需要无菌条件）6。准备细胞。

如果是液氮冻存的细胞，复苏后计数，然后在37℃，５％CO2条件下使得细胞恢复以达到一个较高的密度。

注意：culturemedium中的serum要预测试其合适性，因为serum的选择极大影响背景反应水平和细胞的总体反应。

７.ISPOT实验应该有的control：

Con１：只有细胞cellaloneforbackgroundreactivity。

Con２：只有培养基mediumaloneforfalsepositivespots。

Con３：细胞和丝裂原（如PHA）cellplusmotigenforoverallassayfunctionality。

Con４：细胞和对照多肽库cellpluscontrolpeptidepoolforinternalsamplecontrol。

Con５：外部趋势对照，１～２个参照样品用以测试培养基，对照抗原和丝裂原externaltrendingcontrol，typicallyconsistingof１–２referencesamplestestedagainstmediumalone，acontrolantigen（e.g.，peptidepoolagainstwhichthosesamplesexhibitadetectableresponse）andmitogen。

Positivecontrol：CEFpeptidepool和PHA刺激。

CEFpeptidepool（cat：PM－CEF－E，JPT）：先用纯的DMSO（40μl）溶解，再用1×PBS稀释到终浓度，DMSO的终浓度必须小于1％，以免细胞毒性。

PHA：先加１ml无菌的DPBS或者细胞培养基到5mg的PHA凝集素中，轻轻混匀溶解，使用之前再用无菌的buffer稀释到所需的工作液浓度。注意不要过滤以免损失。

CEFpeptidepool和PHA要稀释到2×的终浓度。

Negativecontrol：培养基＋DMSO，DMSO浓度和CEFpeptidepool中终浓度一致。

８.去除plate中的抗体，无菌PBS清洗plate5遍，每次每孔200μl。

９.最后一遍弃掉液体后，轻轻在无菌纸上扣干。

10.封闭plate：每孔加入200μl１％BSA（0.22μm滤器过滤），室温孵育至少30min。

11.去除封闭液，加入50μlCEFpeptidepool，PHA，阴性对照和刺激物到合适的孔中。

12.Gently铺板细胞，每孔５０μlculturemedium，２～４×105cell／ml（具体的细胞数目需要做梯度摸索），轻拍板的边缘使得细胞均匀铺开，然后放入培养箱，37℃，５％CO2培养16～20h。

注意1：步骤11和步骤12可以合为一步，即先把细胞和刺激物混匀后再加入对应的孔中。

注意2：培养期间不要移动plate，并且采取措施防止蒸发，可以使用铝箔纸包裹plate。

第3天

13.去除platewell中的细胞，然后用PBS＋０.０５％Tween－２０清洗well４～６遍以完全去除细胞，每次200μl。

注意：细胞去除不完全会破坏spot的形成。

14.用０.５％BSAin１×PBS或者０.５％FCS（胎牛血清）in１×PBS稀释生物素标记的检测抗体７－B６－１－biotin至１μg／ml，再用0.22μm低蛋白结合的滤器过滤，然后每孔加入１００μl，３７℃孵育至少２h。

15.清洗platewell，参考步骤３（第２天）。

16.用０。５％BSAin１×PBS或者０。５％FCS（胎牛血清）in１×PBS稀释链霉亲和素－HRP（streptavidin－HRP），每孔加入１００μl，室温孵育至少１h。

注意１：根据显色底物来决定过氧化物酶结合物（peroxidaseconjugate）的稀释度。底物为AEC，推荐１：100稀释度。底物为TMB，推荐１：500～１：1000稀释度。

注意２：HRP结合物（HRP－conjugates）不能在含有叠氮化钠的buffer中使用，因为叠氮化钠会抑制酶的活性。

17.使用１×PBS清洗platewell４～６遍，每次200μl。

注意：不要使用带有Tween－20的washingbuffer，因为Tween－20会干扰spot的形成。

18.加入底物TMB，每孔100μl，直至清晰的spots出现。

注意：底物AEC／TMB稀释后要用0.45μm滤膜过滤。

19.用去离子水来终止显色反应。

20.去除plateunderdrain上所有多余的液体，用纸巾将孔的背部彻底擦干。

注意：残留的底物会引起孔中的色斑。

21.plate在黑暗环境中过夜，彻底晾干。

22.使用ELISPOTreader观察计数。

ELISPOTreader使用方法

读板

１.开机：先开ELISPOTreader，再开电脑。

２.选择CTL。

３.选择扫描软件，即capture。

４.进入扫描向导模式，选择plate类型，MSIP４５。

５.选择保存路径，可以修改。

６.点击eject，弹出载物台，放好plate。

注意：板子的A1孔要和载物台的A1位置对准，然后在弹出的对话框中命名，点击load。

７.点击PreselectWells，可以选择列－column，行－row，单孔－single。

８.修改曝光时间：退出向导，点击preference，这里有仪器的全部设置。点击imagecapturesetting，在exposuresetting里，勾选modifyexposuretime，然后可以修改曝光时间。

９.选择autocenterforeachwell，即相机镜头自动对准样品孔。

１０.点击start，开始读板。

分析

１.点击分析软件。

２.进入选择界面。左边一栏：选择斑点类型，Normal：背景比较干净的；Normaldiffuse：斑点弥散，有点背景的；中间一栏：countingmodule，一般选择智能计数—smartcount；右边一栏：质控－qualitycontrol。

３.点击Smartcount。

①选择板子—loadplate

②定义计数参数—definecountingparameter测试斑点识别的精度，即双击需要识别的孔即可。

斑点识别的是否精确，否的话需要调节参数，Diffuseprocessing，有small，large等可选；在出现白斑的情况下勾选fillholes选项；调大spotseparation可以使连接的斑点分离；勾选hairremoval可以去除头发丝状杂质；调小countarea可以去掉已经选中的孔边缘深色非斑点部分；勾选normalizecounts可以根据斑点的平均分布估算红圈外未选中区域的斑点个数，未勾选则完全删除红圈外的斑点个数，数字后会有一个＊，＊代表有估算的内容在内。

点击BACK，回到原来界面。

③设置阈值－gating

收集阳性孔斑点—collectPOSWells，点击阳性孔，孔上会出现P的标记，然后点击finish。

收集阴性孔斑点—collectNegWells，点击阴性孔，孔上会出现N的标记，然后点击finish。

点击auto－adjust，机器会自动设置阈值。如果阴性孔没有斑点，直接在阳性孔上调节阈值。白色圆圈代表非特异性斑点，其大小在最小阈值以下。

点击startautocount，开始计数。

质控

１.点击质控—qualitycontrol。

２.点击addplates，选择添加板子后，观察板子状态，如果为计数，则状态为scan，如果已经计过数，则状态为counted。

３.点击start，开始质控。

４.处理有问题的孔，最好每个孔都看一遍。

５.双击要处理的孔。

①降低灵敏度，然后点击count，可以去除一些杂质。

注意：调节灵敏度会使一些颜色较浅的信号斑点消失。

②删除斑点：高级设置advancedsetting—去除斑点auditspots，然后点击count，双击选中的杂质斑点，右击选择YES即可删除杂质斑点。删除的斑点系统自动用黑色圆圈圈上。

③删除区域：高级设置advancedsetting—手动模式manualmode，然后点击count，这时可以画圈选取不想要的区域，然后右击闭合，即可选中。

点击manualmode旁边的setting，可以在manual中选中normalize，ignore等选项，normalize即选圈中的部分仍然技术，ignore则为忽略不计数。

④zero：适用于全部阴性孔，可全部删除杂质。

⑤TNTC：toonumeroustocount，即斑点太多而无法计数，需要下次实验调整细胞数目。

６.点击finishtonextplate即完成一块板子。