2021-08-05请教：elisa实验TMB底物孵育时间和温度的问题

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我用的试剂盒是avivasystem的，TMB底物加入之后感觉反应太过剧烈，加入之后高浓度的孔立即就开始变蓝，说明书是37度15-30分钟，孵育恰当的标准是：高浓度四孔变蓝色，低浓度（包含空白孔）无明显蓝色。我实际操作过程中，37度孵育15分钟已经全部孔变蓝，最终测下来od值过高，标曲八个点，空白0.2+，高浓度两空3以上，结果就是前六个点还是线性挺好的（r=0.9991），高浓度两个点完全不行。另一个问题是：我摸索了待测血清的稀释浓度，分别是不稀释、1/10、1/50、1/100，结果不稀释和1/10两个浓度测出来是负值（od小于空白对照），1/50和1/100测出来的值在标曲范围内（只取了线性好的前六个点），但是测值和稀释倍数也不成比例。请教各位：1.听人说TMB底物常温避光反应也可以，我能不能常温呢？这样我就好控制反应时间，还是继续37度孵育，把孵育时间缩短到10分钟甚至5分钟2.高浓度血清标本（不稀释、1/10稀释）测出负值应该怎么解释，厂家技术支持说可能浓度太大影响抗原抗体结合，这个能说得通吗？3.空白孔是不是应该不变色才对？空白孔显色是不是洗板时孔间污染导致的？要是这样的话，为什么前六点（含空白）标曲是好的？谢谢大家了

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dong3504269

回复：时间：2017-09-16

1.听人说TMB底物常温避光反应也可以，我能不能常温呢？这样我就好控制反应时间，还是继续37度孵育，把孵育时间缩短到10分钟甚至5分钟一般来讲标曲应当是厂家优化过后的，不应该存在这么大的问题，会不会是你在孵育完酶标抗体之后洗涤不充分，孔内残留的非特异性结合的酶标抗体太多，导致所有孔OD值偏高。常温避光也是可以的，37度只是因为这是酶的最适工作温度，换成室温的话，盒子的灵敏度肯定会下降2.高浓度血清标本（不稀释、1/10稀释）测出负值应该怎么解释，厂家技术支持说可能浓度太大影响抗原抗体结合，这个能说得通吗？这个是说的通的，术语叫做勾状效应（Hook effect），你百度一下就明白了，高浓度的抗原导致的假阴性，所以样本一定要稀释到合适的浓度。3.空白孔是不是应该不变色才对？空白孔显色是不是洗板时孔间污染导致的？要是这样的话，为什么前六点（含空白）标曲是好的？理论上是不显色的，但实际操作中，除了抗体与抗原间的结合外，难免有一些非特异性的吸附，这都会导致空白孔显色，空间污染一般会导致某一孔的OD值明显出现大的偏差，不会落在标曲上的

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jilin1117

回复：时间：2017-09-16

感谢楼上老师专业详尽的解答，我再试试看。小弟在此谢过

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pharmacology努力

回复：时间：2017-09-17

请问TMB微微有点蓝色还能用吗，我显不出来

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