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我用师哥以前剩的PCR的下游引物作为探针,有18bp,这么短的序列能用地高辛标记吗?地高辛能不能标记上?我看试剂盒写的是每20-25个新合成的核酸就有一个DIG标记的dUTP.是不是探针太短了,标记不上呀?多谢了!
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回复:时间:2021-07-23
18nt,与其标,还不如直接合成DIG修饰的引物,也就500RMB左右吧,你为啥非要费老劲儿去标,试剂盒原理是随机引物结合后,利用Klenow片段延伸,在延伸过程中用dUTP-dig取代T,虽然是随机引物,但是与18nt模板结合的概率也低了点吧,就算结合上了,供你延伸的区域能有几个核苷酸?18nt上有几个T你有没有看过?这个跟标记的效率直接相关。再加上标记并不是100%的标,有可能部分产物是没标上的。上面几个因素下来,估计你后面的光排除问题花的都不止500RMB,你说为啥不直接合成DIG标记的引物呢?
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回复:时间:2021-07-24
多谢你了。问题是实验室里有地高辛标记试剂盒(试剂盒有四或者五年了),还有师哥剩的引物可以当探针,这些都是现成的,老板要我们做原位杂交,意思是利用实验室有的东西做。要花500元买探针肯定是行不通的。我们的探针是AATGGAGTCACCAGCAGA。实验室条件有限啊,不得不自己标记。如果这样的序列太短不能标记的话,那我们只能让公司合成探针,然后我们自己再标记。请教你我们的探针是不是可以标记?非常感谢!
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回复:时间:2021-07-21
不行了吧,太小了。反正我这的说明书上说了,最小为100bp,但最好也不要超过500bp。如果其大于500bp的话,可以用4bp的酶(例如haeIII)来消化。
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