2021-08-11蛋白质的N末端测定

N-末端测定　　A.二硝基氟苯法(FDNB,DNFB)：1945年Sanger提出此方法,是他的重要贡献之一.　　DNP-氨基酸用有机溶剂抽提后,通过层析位置可鉴定它是何种氨基酸.Sanger用此方法测定了胰岛素的N末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸.　　B.氰酸盐法：1963年Stank及Smyth介绍了一种测定N末端的新方法,步骤如下：　　由于乙内酰脲氨基酸不带电荷,因此可用离子交换层析法将它与游离氨基酸分开,分离所得的乙内酰脲氨基酸再被盐酸水解,重新生成游离的氨基酸,鉴别此氨基酸即可了解N-末端是何种氨基酸.　　C.二甲基氨基萘磺酰氯法：1956年Hartley等报告了一种测定N-末端的灵敏方法,采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯,简称丹磺酰氯.它与游离氨基末端作用,方法类似于Sanger的DNFB法,产物是磺酰胺衍生物.　　丹磺酰链酸具有强烈的黄色荧光.此法优点为灵敏性较高(比FDNB法提高100倍,样品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(对酸水解稳定性较DNP氨基酸高),可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定.

Eadam降解法是一种化学法对蛋白质进行测序的方法，是从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。N末端氨基酸残基被苯异硫氰酸酯修饰，然后从多肽链上切下修饰的残基，再经层析鉴定，余下的多肽链（少了一个残基）被回收再进行下一轮降解循环。P.Edman降解测序主要涉及耦联、水解、萃取和转换等4个过程。首先使用苯异硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的碱性条件下对蛋白质或多肽进行处理，PITC与肽链的N-端的氨基酸残基反应，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。然后PTC-肽用三氟乙酸处理，N-端氨基酸残基肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下来将该衍生物用有机溶剂（例如氯丁烷）从反应液中萃取出来，而去掉了一个N-端氨基酸残基的肽仍留在溶液中。萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸作用，再进一步环化，形成一个稳定的苯乙内酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸（下图）。留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程，整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行。每一循环都获得一个PTH-氨基酸，经HPLC可以鉴定出是那一种氨基酸。Edman降解的最大优越性是在水解除去末端标记的氨基酸残基时，不会破坏余下的多肽链。当蛋白质中含有一个或多个半胱氨酸残基时，有时一对半胱氨酸残基会通过二硫键交联。在这种情况下测序，首先要经过处理（如用过甲酸处理）切断二硫键，然后再进行Edman降解测序。展开

检测N末端主要有3种方法：蛋白质的末端氨基与2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白质（DNP-蛋白质）。产物黄色，可经受酸性100℃高温。水解时，肽链断开，但DNP基并不脱落。DNP-氨基酸能溶于有机溶剂（如乙醚）中，这样可与其他氨基酸和ε-DNP赖氨酸分开。再经双向滤纸层析或柱层析，可以鉴定黄色的DNP氨基酸。丹磺酰氯法是更灵敏的方法。蛋白质的末端氨基与5-(二甲胺基)萘-1-磺酰氯(DNS-Cl)反应，生成DNS-蛋白质。DNS-氨基酸有强荧光，激发波长在360nm左右，比DNFB法灵敏100倍。目前应用最广泛的是异硫氰酸苯酯(PITC)法。末端氨基与PITC在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来。产物可用气-液色谱法进行鉴定。这个方法最大的优点是剩下的肽链仍是完整的，可依照此法重复测定新生的N末端氨基酸。现在已经有全自动的氨基酸顺序分析仪，可测定含20个以上氨基酸的肽段的氨基酸顺序。缺点是不如丹磺酰氯灵敏，可与之结合使用。

囧。。。。分子克隆上写了几十页的东西，自己查查嘛表告诉我们你不知道啥是分子克隆。。。。