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酵母菌基因组转座子的诱变实验一基本方案
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实验方法原理 | |
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实验材料 | 诱变转座子基因组文库质粒DNA |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | 临床用台式离心机、45℃水浴或孵育箱、无菌牙签、3MM无菌滤纸(Whatman) |
实验步骤 | 1)溶液干了之后,从转座子诱变基因组文库的个体库里分配质粒DNA(每个库约为1μgDNA)。短时间离心每个干的样品,用pH8.0的TE缓冲液以合适的容积重悬每个库的DNA(如每个库10体积)。文库DNA的每个库都被单独诱变;所以分开处理每个库的DNA以保证得到独立插入等位基因。 2)从每个库中取适当的DNA的量,以标准的转化步骤转入对任何四环素(tets)和卡那霉素(kans)敏感的大肠杆菌菌株内。 3)在加入3pg/mL的四环素和40μg/mL的卡那霉素的直径为14cm的LB培养基平板上挑选转化株。 4)通过在每个平板表面加6mL的LB培养液洗脱转化株克隆并刮取细胞使成为均匀的悬液。保存一部分悬液;-70℃下于15%的丙三醇里保存。 5)用100mL含3μg/mL四环素和40μg/mL卡那霉素的LB培养基稀释1mL这种洗脱液,进行培养使细胞密度几乎达到饱和。在通风的条件下,37℃孵育2〜3h。 6)通过标准的小量制备或大量制备来分离质粒DNA。 7)用非限制性内切核酸酶NotⅠ消化来自每个库的小量(典型的量至少为1μg)的质粒DNA(在步骤6中获得)。接下来为了确保mTn诱变的酵母菌DNA从pHSS6载体上释放,取一部分反应混合物,用琼脂糖凝胶电泳法进行分析。剩余的反应混合物于4℃保存以备后用(见步骤10)。在电泳凝胶上可以看到一条清楚的2.1kb的pHSS6条带和一条宽的8kb的mTn诱变的酵母菌基因组DNA条带。 8)取10mL要用作研究的Um3-酵母菌株培液进行培养,使其处于对数生长期(密度为1O7细胞/mL或OD600约为1)保持适合的选择,以备应用。 9)临床用台式离心机于室温下1100g将细胞离心5min,用5体积的一步缓冲液洗涤沉淀物一次。 10)在1mL的一步缓冲液里加入1mg变性的鲑精DNA并重悬细胞,在装有0.1〜1μL的从步骤7中得到的用非限制性内切核酸酶I消化的质粒DNA的微型离心管里加入100μL的重悬液,在涡旋振荡器上振荡使其充分混合。 11)45°C孵育混合物30min。 12)室温下微型离心机上以最大速度将细胞离心5s,随后在400μL的CM(-Ura)缺失成分培养基中重悬沉淀物。取200μL重悬液加到CM(-Ura)缺失成分培养基平板上。30℃孵育3〜4天。 13)为了最大限度检测出在低水平表达的hcZ-融合产物,将转化克隆以每平板达到100个克隆的密度用无菌牙签转移到YPAD培养基平板上。 14)在CM(-Ura)缺失成分培养基平板上放置一个3MM无菌滤纸圆片;在许多要用的培养基平板上重复此操作。将转化态细胞复制到滤纸覆盖的平板上,以易于鉴定YPAD培养基平板上相应的克隆(步骤13),30℃孵育过夜。 其他生长条件(如在孢子形成培养基上生长)可以根据需要取代上述条件。 15)过夜生长后,从平板上拿起滤纸并放在一个9cm的玻璃皿的盖子里。把这个盖子放进盛有氯仿的一个15cm的闭合的玻璃皿里。孵育10〜30min溶解菌株。 16)将滤纸克隆面向上放在很薄的λ-gal培养基平板上,30℃转化孵育2天。 17)从步骤13得到的再生的YPAD培养基平板上找出产生λ-gal的克隆株(在λ-gal培养基平板上表现为蓝染)。在以后的菌株生长和处理中保持适当的选择。 |
注意事项 | |
其他 | 其他所需: YPAD培养基平板:加入80mg/L腺嘌呤的YPD培养基平板,氯仿,λ-gal培养基平板 |