一、材料

1.缓冲液及溶液

碱性转移缓冲液（应用于尼龙膜的碱性转移）（0.4mol/LNaOH，1mol/LNaCl）

变性溶液（应用于中性转移）（1.5mol/LNaCl，0.5mol/LNaOH，HCl(0.2mol/L)，应用于DNA的脱嘌呤）

中和缓冲液Ⅰ(应用于不带电荷的尼龙膜的转移）（1mol/LTris(pH7.4)，1.5mol/LNaCl）

中和缓冲液Ⅱ(应用于尼龙膜的碱性转移）（0.5mol/LTris-Cl(pH7.2)，1mol/LNaCl）

中性转移缓冲液（10XSSC或10XSSPE)（6XSSC，6X蔗糖凝胶上样缓冲液，SYBRGold或溴化乙锭，TE(pH8.0)）

2.酶及缓冲液

适当的限制性内切核酸酶

3.凝胶

用0.5XTBE或1XTAE配制的无溴化乙锭的琼脂糖凝胶（0.7%)

4.核酸及寡核苷酸

DNA大小标记物

基因组DNA

5.专用设备

交联设备（例如Stratalinker,Stratagene;GSGeneLinker,Bio-Rad),或者微波炉，或真空炉

玻璃烤盘

大口径的黄吸头

氯丁橡胶塞

尼龙或硝酸纤维素膜

树脂玻璃片或玻璃碟

旋转振荡平台

厚的吸水纸（例如，Whatman3MM,Schleicher&SchuellGB004,或SigmaQuickDraw)

荧光标记的透明尺

重物（400g)

二、方法

1.DNA的消化及电泳

(1)用一种或几种限制性内切核酸酶消化适当数量的DNA。

使用大口径黄吸头操作大分子DNA。

(2)如果需要，消化结束后用乙醇沉淀浓缩DNA片段。将DNA溶解于约25μlTE(pH8.0)。

(3)通过荧光测量法或者溴化乙锭或SYBRGold斑点实验测定DNA消化产物的浓度。将适量的消化产物转移到新的微量离心管中。加入0.15倍体积的蔗糖上样缓冲液，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段（对于大部分基因组DNA,可以使用1XTAE或0.5XTBE配制的0.7%的凝胶）。对凝胶加一较低的电压（约<1V/cm)使DNA以较慢的速率迁移。

(4)电泳充分进行后，将凝胶用溴化乙锭或SYBRGold染色然后照相。在凝胶一侧放置一把透明荧光尺以便从照片上直接读出每一DNA条带迁移的距离。

(5)DNA变性，使用下列方法之一将DNA从凝胶上转移到硝酸纤维素膜或者中性或带电荷的尼龙膜上。

2.准备用于转移的凝胶

(1)电泳分离DNA之后，将凝胶转移到一玻璃烤盘中。用锋利的剃须刀片修去凝胶边缘无用的部分，包括加样孔上方的凝胶。在凝胶上保留足够的加样孔以便DNA转移结束后将加样孔的位置标记于膜上。在凝胶左下角切去一小三角形（加样孔一端为下)，以此作为以下操作过程中凝胶方位的标记。

(2)按以下步骤将凝胶置于变性溶液（碱性）中进行DNA变性。

①转移到不带电荷的膜上

A.将凝胶置于10倍于凝胶体积的变性溶液中室温下放置45min并且轻轻振荡（例如，放在一个振荡平台上）。

B.用去离子水短暂浸泡凝胶，然后将凝胶浸于10倍于凝胶体积的中和缓冲液Ⅰ中室温下放置30min,并轻轻振荡。换一次中和缓冲液继续浸泡凝胶15min。

②转移到带电荷的尼龙膜上

A.室温下将凝胶浸于数倍体积的碱性缓冲液中15min并轻轻振荡（例如，放在一个振荡平台上)。

B.换液一次继续浸泡凝胶20min,并轻轻振荡。

3.准备转移用膜

(1)用干净的解剖刀或切纸机切一张每边均比凝胶大1mm的尼龙膜或硝酸纤维素膜。再切两张与膜同样大小的厚吸水纸。

(2)将膜漂浮于盛有去离子水的皿中直到膜从下往上完全浸湿，然后将膜浸入适当的转移缓冲液中至少5min。用干净的解剖刀片切下膜的一角，与凝胶切下的一角相一致。

4.组装转移装置及DNA的转移

将DNA转移至不带电荷的膜时需使用中性转移缓冲液（10XSSC或10XSSPE)。碱性转移缓冲液0.4mol/L的NaOH及1mol/L的NaCl应用于将DNA转移至带电荷的尼龙膜时。

(1)DNA进行变性的过程中，将一张厚的吸水纸放在一片树脂玻璃板或玻璃皿上形成比凝胶长且宽的支持物。吸水纸两端需要从皿的边缘垂下。将支持物放于一个大的干烤皿中。支持物可以放在四个氯丁橡胶塞上将其从皿的底部垫高。

(2)皿中放入适当的转移缓冲液直到液面几乎与支持物表面平齐。当支持物上的吸水纸完全湿润后，用一只玻璃棒或吸管赶走气泡。

(3)将凝胶从溶液中取出并倒转使原来的底面向上。将倒转的凝胶放在支持物上并位于吸水纸中央。

(4)用Saran包装膜或Parafilm膜围绕凝胶四周，但不要覆盖凝胶。

易从凝胶边缘垂下并与平台接触。这种短路是DNA从凝胶向膜转移效率低下的主要原因。

(5)用适当的转移缓冲液将凝胶湿润。将湿润的膜放置于凝胶上并使两者切角相重叠。为避免产生气泡，应当先使膜的一角与凝胶接触再缓慢的将膜放到凝胶上。膜的一条边缘应恰好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。

重要：膜一旦放在凝放表面就不要再移动了。膜与凝胶之间不应留有气泡。

(6)用适当的转移缓冲液湿润两张厚的吸水纸并放置于湿润的膜上。用吸管赶走滞留的气泡。

(7)切或者叠一叠略小于吸水纸的纸巾（5~8cm高)。将纸巾放在吸水纸上。在纸巾顶部放一块玻璃板然后用一400g重物压实。

(8)DNA转移需进行8~24h。当纸巾湿润后更换新的纸巾。尽量避免整叠纸巾都被缓冲液浸湿。

(9)除去凝胶上的纸巾以及吸水纸。翻转凝胶以及与之接触的膜，凝胶向上平放于干燥的吸水纸上。用一支极软铅笔或圆珠笔标记加样孔的位置。

(10)将凝胶从膜上剥离，弃去凝胶。

5.固定DNA于膜上

从将DNA固定于膜上到其后的杂交，这一系列步骤的顺序取决于膜的种类、转移的方法以及固定的方法。由于碱性缓冲液将导致DNA共价结合于带正电荷的尼龙膜上，因此在杂交前不需要将DNA固定在膜上。在中性缓冲液中转移至不带电荷的尼龙膜的DNA需要真空烘烤或者用微波炉加热以固定于膜上，或者用紫外照射交联于膜上。



(1)将膜浸于适量的下列溶液之一：

中性转移：6XSSC，室温5min。

碱性转移：中和缓冲液Ⅱ[0.5mol/LTris-Cl(pH7.2)及1mol/LNaCl],室温15min。

(2)固定已经转移到不带电荷的膜上的DNA

①通过真空烤箱来固定

A.将膜从6XSSC中取出并使多余的液体流净。将膜放在纸中上室温下晾干30min。

B.将膜夹在两张干燥的吸水纸中间。在真空炉中80℃烘烤30min~2h。

②用微波炉烘烤固定

A.将潮湿的膜放在一张干燥的吸水纸上。

B.将微波炉调至最大功率（750~900W)对膜加热2~3min。

③通过紫外照射交联

A.将潮湿的膜放在一张干燥的吸水纸上。

B.254nm照射使DNA交联到膜上（Khandjian1987)。

(3)直接用探针对固定化的DNA进行杂交。