一、材料

1.培养基

(1)含有适当抗菌素的LB或SOB琼脂板。

本方案中使用2~3天旧板效果最好，因为旧板更容易吸收接种物中的水分。

(2)含有适当抗菌素和25%(V/V)甘油的LB或SOB琼脂板。

(3)含有氯霉素的LB或SOB琼脂板。

氯霉素贮存液浓度应为170~200μg/ml。

2.专用设备

平头镊子（如Millipore镊子）

18号针头

硝酸纤维素膜（MilliporeHATF，或相当产品）或尼龙膜，无菌无去污剂污染

注射器（3cc）

Whatman3MM圆形滤纸。（提前准备一叠Whatman3MM滤纸（毎一硝酸纤维素或尼龙膜各准备一叠，还要加一些备用品），并裁减成比滤膜稍大一点。一些厂家已有预制好的圆形滤纸出售。用铅箔包好滤纸，高温高压消毒[15psi(1.05kg/cm²)10min]。

3.载体和菌种

重组质粒转化的E.coli，用作培养物。

或

扩增的cDNA文库，生长为培养物。

二、方法

1.用软铅铅笔或圆珠笔在干滤膜上作好标记，用水浸湿后将湿滤膜夹在干的3MM滤纸之间，用铝箔松散地包好，液相循环高温高压消毒[15psi(1.05kg/cm²)10min]。

准备足够的滤膜用来从起始板制备1或2张备份。备份最好用消毒的无菌滤膜，但如果不再从主板制备备份，未消毒的滤膜也可以用。

2.用平头镊子将一张消过毒的滤膜，标记面向下，置于含有适当抗菌素的LB或SOB琼脂板已制备2~3天，滤膜完全浸湿后，将其从板上揭下，翻过来标记面向上，再置于琼脂板表面。

3.将小体积的菌液置于琼脂板表面的滤膜中心，用一个无菌玻璃棒使菌液分散，在滤膜四周留出2~3mm宽的无菌区。

大滤膜（直径137mm）可提供0.5ml细菌悬液，含2X10⁴个活菌；小滤膜（直径82mm)提供0.2ml细菌悬液，含~10⁴个活菌。

4.将琼脂板的盖半开（不要倒置）置于通风橱内数分钟使接种物中的水分蒸发，盖上盖子，颠倒琼脂板于37℃培养直至出现直径0.1~0.2mm的小菌落（约8~10h)。

5.如需要，可在此时按步骤6制备备份滤膜，否则按以下步骤使菌落可冻存于-20℃：

(1)将滤膜菌落面向上转移至含有适当抗菌素和25%甘油的LB或SOB琼脂板表面。

(2)于37℃培养2h。

如进行cDNA文库筛选，最好将主板冰冻。冰冻可减少真菌污染使主板保存数月。含有抗菌素但不含甘油的LB或SOB板上的主滤膜可在4℃保存2周。

(3)用Parafilm膜封好琼脂板，颠倒置于封闭的塑料袋的于-20℃保存。

于室温使主板（仍以颠倒位置)解冻后即可制作备份。

6.将主膜（硝酸纤维膜或尼龙膜）菌落面上置于无菌的Whatman3MM滤纸上。

7.标记一张湿的硝酸纤维膜或尼龙膜，置于主膜上，防治在两膜之间形成气泡。

最好将第二张滤膜稍微卷曲，以使两张滤膜首先在中部接触。两膜一旦接触，就不要相互移动。尽量使两张滤膜不要完全重叠，以便于以后使两者分离。

8.在滤膜上再盖一张圆形3MM滤纸，并在滤纸上放一个培养皿，用手掌向下紧压培养皿以使细菌从主膜转到滤膜上。

9.拿掉培养皿和顶层3MM滤纸，用连接注射器的18号针头在双层滤膜作一些空，以作标记方位。

确保针头剌穿两层滤膜。

10.使两膜分开，将备份膜置于新鲜的含有适当抗菌素的LB(或SOB)琼脂板。

此时，可按步制备第二张备份，用主膜上已有的孔标记第二张备份膜。

11.将另一张备份膜和主膜置于新鲜的含有适当抗菌素的LB(或SOB)琼脂板，于37℃培养，直到长出菌落（4~6h)。

12.这一阶段，当细菌生长依然很快，滤膜可以转到含有氯霉素的（170~200μg/ml)的（或SOB)琼脂板，于37℃培养12h。

13.将主膜转到新鮮的含有适当抗菌素和25%甘油的LB(或SOB)琼脂板，而后按步骤5冻存。

14.裂解附着于备份膜上菌落，将释放出的DNA固定于硝酸纤维膜或尼龙膜。进行杂交。